一种分析肝细胞肝癌免疫和循环微环境的新方法

尹灿昆，赛音·贺西格，宿杰·阿克苏，纪 元

病理组织大切片相比常规切片，可对肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)部分肝脏手术标本的最大切面的形态和免疫微环境进行广泛分析，是一种已被广泛开展使用的方法[1]。共聚焦荧光显微切片可从三维角度对肿瘤免疫微环境进行更为细微的观测，配合多重抗体标记和荧光显色多通道切换，同一张切片可反映数种免疫细胞和蛋白的分布情况和表达量[2]。本实验将结合上述两种研究方案，利用扫描所得的高精度全息图像，从广度和深度上共同拓展探究HCC脉管及免疫微环境新技术的可行性与优越性，截取并记录相应的具有临床或实验研究价值的信息以供证明。

1 材料与方法

1.1 材料收集2018年3～12月在复旦大学附属中山医院首次诊断为HCC并行根治性切除术的患者，术后病理诊断为HCC的手术标本。以肿瘤长径2～5 cm，标本总长径不超过7 cm为标准获取数例标本适用于行病理组织大切片制作。经筛选，10例HCC切除标本被制成病理组织大切片，10例HCC标本均存在HBV感染，组织学分化为Ⅱ～Ⅲ级。10例中有1例因肿瘤大小适中、荧光染色效果较好，被用于制作共聚焦荧光显微切片。

1.2 方法除共聚焦荧光显微切片需经4%多聚甲醛固定、冷冻切片和行多重免疫荧光染色，其余均经10%中性福尔马林固定和石蜡包埋切片、行HE和免疫组化EnVision染色，抗体包括CD3(LN10)(Leica公司)、CD8(4B11)(Abcam公司)、CD34(QBEnd/10)(长岛公司)、E-cadherin(Dako公司)。

2 结果

成功获取实验所需的HCC大切片及共聚焦荧光显微切片，并对具有一定临床实验价值的图像进行了观测，初步探索并得到具有一定研究意义的结果。

2.1 取材、制片

2.1.1大切片巨检取材制片 取材流程包括：标本取材前拍照；大切片、共聚焦和常规取材定位(图1A)；剩余标本完整取材。切片可完整包含标本的最大切面，组织断面面积一般是小切片的4～6倍(图1B)。肿瘤最大切面的整体形态在大切面上得到完整呈现，其旁间质增生反应区和周围肝脏彼此也能较好区分。

图1 肝细胞肝癌大切片取材及成片效果：A.大切片、共聚焦和常规取材同步进行；B.大切片与一般病理切片成片效果对比

2.1.2共聚焦荧光显微切片制片 1～2 mm厚度的HCC组织经多聚甲醛固定和蔗糖溶液脱水用于制作共聚焦荧光显微切片，因这类组织比常规冷冻切片大很多，所以需要承载面更大的冷冻头来进行切片。经探究，将OCT冷冻后涂布在冷冻头上，反复冷冻可拓展冷冻头承载面(图2A)。将切好的切片捞入标记抗体所用的十二孔板可对组织充分染色，而实验捞、爬片所用的针灸针则是一类可不伤及样本的制片工具，易获取，便于携带(图2B)。抗体标记完成后经充分洗涤，最后封片用于扫描成像。

图2 共聚焦免疫荧光厚切片取材制片要点：A.利用OCT反复涂布/冷冻，拓展承载范围； B.PBS悬浮漂洗组织切片并使用针灸针制成的捞片器具爬片

2.2 观测

2.2.1大切片 观测10例大切片中，有1例HCC具有极为丰富的形态学改变状态，包括了癌前病变、肿瘤脂肪变/播散灶形成(图3)和微脉管癌栓广泛播散。这些诊断位点均位于同1张大切片上，可迅速、全部观测到。

图3 1例大切片案例内具有多种形态-免疫学改变的肝细胞肝癌及周围组织，包含脂肪变、大细胞变和免疫细胞热点

2.2.2共聚焦 荧光显微切片观测HCC血管新生伴炎细胞集中与浸润，常规免疫组化切片的厚度有限，且因为抗体标记后辨识度较低，仅能粗略的对标本的血管丰度和分布情况进行估计，血管的层次、细微结构及周围肿瘤、免疫细胞浸润层次则较难进行判读。共聚焦荧光显微切片厚度已达到立体观测要求，复合荧光染色配合光线通道切换，既可单独观测血管的结构或淋巴细胞的分布状况，又可复合后进行联合判读以对各类细胞间的关系进行细分和统计。一方面，T细胞广泛分布在HCC周围肝脏，并集中分布在胆管内，少有分布于HCC内部的案例。另一方面，常规免疫组化切片中的T细胞集中分布区域内的T细胞阳性染色堆叠与重合均会影响计数，造成数据失真(图4A)。共聚焦荧光显微切片可较好的凸显T细胞在炎症热点中的位置，标记效果显著优于常规免疫组化，堆叠形成的复合图像具有明显的空间感，较易计数(图4B)。对实际面积相同的免疫组化与共聚焦免疫荧光切片计数后再进行对比，结果表明它们在肿瘤内部、间质增生反应区、胆管增生区和周围肝脏内的T细胞表达强度(单位面积T细胞数目)上差异有统计学意义(图4C)。

图4 同一案例普通免疫组化切片和共聚焦荧光显微厚切片成像和细胞计数结果对比：A.普通切片成像效果；B.共聚焦荧光显微成像效果；C.单位面积计数结果对比(Image J计数，Graphpad 7.0制图)

3 讨论

HCC是一种常见的消化系统恶性肿瘤，具有高侵袭性、复发性及致死性的特点。放、化疗和介入治疗虽能使临床治愈肿瘤，但无法修复肝脏的内环境，特别是免疫微环境，从而无法消除HCC复发和转移的温床。免疫治疗作为一类新兴的肿瘤治疗方法，不仅可以重新激活或强化淋巴细胞杀伤肿瘤细胞，更具有使组织微环境恢复稳态的潜能。然而，这需要对肿瘤的免疫微环境进行系统详尽的观测和及时监控，因而一系列更为先进的观测手段有待进一步开发，特别是不破坏组织结构的形态-免疫综合研究[3]。病理学上，普通的HE和免疫组化切片显然已不能满足日益增长的肿瘤微环境精准观测需求，若进行常规取材，则需分区域分别采集，导致观察不连续，同时又可能造成遗漏，从而影响标本评估和诊断的准确性[4]。病理组织大切片作为提示形态学特异性改变和免疫微环境变化的载体，涵盖了标本切面所有可能具有病理学意义的位点，是一种良好的图像观测和数据收集载体。本实验自创的HCC共聚焦显微切片在对具有多种形态分化、多侵犯转移倾向的HCC信息反馈上具有比常规切片更大的优势，所包含的潜在的有临床价值的位点数目也更多更全。现当务之急是需要开发一类可对其进行扫描的、适配多尺寸玻片的切片扫描仪，从而解决这类切片的数字化管理问题。此项研究表明，HCC大切片不仅可行，而且可涵盖更丰富的组织学信息，相较于侧重诊断的肝脏多点取材法，大切片则更适用于需要更多方面获取信息的肝脏组织学实验，且同时省略了后续诊断后补充取材这一过程，在后续辅助诊断和实验中也有更多的选材斡旋余地。另一方面，共聚焦荧光显微切片是本实验的难点，但它也从立体角度进一步丰富了组织切片的观测丰度与层次，解决了在同一张切片行多种免疫组化染色并联合观测，可较为清晰反映组织空间细微结构和免疫细胞的分布情况，与传统玻片相比，是一种更适合进行形态-免疫综合量化分析的工具，能够反应常规免疫组化所不能体现的血管细微结构、细胞对组织浸润的层次和局部炎症热点的各类细胞分布情况。本实验结果均表明共聚焦荧光显微切片具有替代传统免疫组化切片，进行免疫微环境数字化分析的潜力。然而目前亟待解决的问题是如何研发可以以较低的代价进行大批量生产的技术平台，如何开发和完善出可深度量化分析的多能数字切片分析工具、如何捕捉和汇总共聚焦荧光显微数字切片内所包含的、可能具有临床和预后价值的图像信息和如何对所得到的数据进行合适的统计学分析[4]。

肝脏的炎症高表达和HCC免疫细胞低表达于HCC中共存，表明HCC的免疫微环境中存在的免疫细胞与肝脏内的免疫细胞极有可能在分化和功能上均存在差别，亟需鉴别并细分HBV感染相关、HCC肿瘤免疫相关和非功能性免疫细胞。实验同样观测到，在出现转移倾向的区域(肿瘤包膜突破浸润、子灶、部分MVI)可见大量T细胞浸润，这也表明HCC的复发和转移与T细胞有较大关系。实验中T细胞在肿瘤内部表达出现缺失或阳性减弱，但在周围肝脏组织内的表达并未受到影响，表明不同区域的免疫细胞有着不同的激活来源，同时在表达的过程中会因微环境的改变而发生转分化、表达缺失和再激活等改变[5-7]。

作者在进行HCC免疫微环境全面量化的过程中尝试了以大切片引导、共聚焦荧光显微切片定位分析的方案。病理组织大切片结合共聚焦荧光显微切片，在人HCC的微环境再现、观测和量化上，要优于普通的HE和免疫组化切片，但其制作成本及难度也大大限制了其应用范围。这种方案经试验验证，具有一定的可行性，有望在大切片扫描、全层等相关技术成熟后，以数字切片的方式进行多维深层次量化分析，成为更丰富且更为准确的免疫微环境量化数据的来源。