TOPⅡ、IDH1表达与胶质瘤预后的相关性及临床价值

陈 洋，阴鲁鑫，李琳琳，王天男，刘宇昊，高文昌

胶质瘤是源自神经上皮最常见的脑恶性肿瘤，占原发性成人脑肿瘤的70%。胶质瘤易复发且具有浸润性，预后不良[1]。高级别胶质瘤最具侵袭性，近50%的患者在1～2年内死亡。由于胶质瘤多呈浸润性生长，手术彻底切除难度大，复发率高，且化疗副作用大，因此基因治疗和靶向药物治疗成为当今全球研究胶质瘤的热点。研究表明，拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, TOPⅡ)的表达与脑胶质瘤的恶性程度有关，可能影响患者的预后[2-3]。异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1, IDH1)作为胶质瘤预后的主要分子标记，可能提示较好的预后[4]。本文回顾性分析89例胶质瘤标本，探究TOPⅡ、IDH1与胶质瘤恶性程度及其预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2014年1月～2017年10月徐州医科大学附属医院神经外科行手术切除并经病理检查确诊的胶质瘤标本89例，其中男性48例，女性41例，年龄23～74岁，平均50.6岁。包含高级别胶质瘤56例，其中间变性星形细胞瘤(Ⅲ级)18例，胶质母细胞瘤(IV级)38例；低级别胶质瘤33例，其中少突胶质细胞瘤(Ⅱ级)8例，星形细胞瘤(Ⅱ级)25例。

1.2 随访对患者本人或家属进行电话随访，随访时间自患者手术日开始，截至2019年12月，每隔数月定期随访，随访内容包括患者术后是否放化疗、是否死亡及死亡具体时间，直至随访结束，期间失访8例，失访人员不纳入统计范围。

1.3 试剂即用型鼠抗人TOPⅡ单克隆抗体和IDH1 R132H鼠抗人单克隆抗体均购自北京中杉金桥公司，DAB显色剂、EDTA(pH 8.4)修复液、PBS缓冲液、二抗均购自罗氏(上海)公司。

1.4 方法标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，分别行HE及免疫组化EnVision法染色，染色步骤严格按试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木精复染，返蓝；乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5 判断标准结果由两位有经验的病理医师阅片后，取得一致意见，以肿瘤周围正常脑组织作为内对照。免疫组化染色结果以细胞膜、质、核中分别存在粗细一致的棕黄色颗粒为阳性。IDH1为胞质阳性，光镜下随机观察数个高倍视野，记录高倍视野中阳性细胞的百分率，采用染色判定标准：肿瘤细胞数≥5%即IDH1阳性(IDH1突变型)。细胞核阳性为TOPⅡ阳性，每张切片计数所有TOPⅡ阳性细胞数/肿瘤细胞总数，为TOPⅡ的百分比，阳性肿瘤细胞数≥5%为阳性。

1.6 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计数据分析，TOPⅡ、IDH1表达与胶质瘤恶性程度的关系用χ2检验分析，TOPⅡ、IDH1在胶质瘤中的表达采用Spearman等级相关分析法，临床因素与生存时间的关系用Kaplan-Meier生存曲线表示，再用Log-rank法分析，多因素采用Cox回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TOPⅡ、IDH1表达与胶质瘤恶性程度的关系TOPⅡ、IDH1表达与胶质瘤病理级别有关。TOPⅡ在低级别胶质瘤中的阳性率为26.7%，在高级别胶质瘤中的阳性率为90.2%(图1A)；IDH1在低级别胶质瘤中的阳性率为63.3%(图1B)，在高级别胶质瘤中的阳性率为9.8%(表1)。

表1 不同级别胶质瘤组织中TOPⅡ和IDH1的表达

图1 A.胶质瘤组织中TOPⅡ阳性，EnVision法；B.胶质瘤组织中IDH1阳性，EnVision法

采用等级相关分析TOPⅡ与IDH1表达之间的关系(表2)，Spearman等级相关分析结果显示，TOPⅡ与IDH1在胶质瘤中的表达呈负相关(r=-0.459，P<0.001)。

表2 胶质瘤组织中TOPⅡ与IDH1表达的相关性

2.2 胶质瘤患者预后的影响因素各因素与生存时间的关系采用生存曲线表示(图2)，用Log-rank检验计算中位生存期和1年生存率，根据临床病理因素分组(表3)，结果显示，患者年龄、病理级别、术前KPS评分、术后放化疗、TOPⅡ表达和IDH1表达与患者预后有关，与患者性别无关。IDH1阳性患者生存期较长，TOPⅡ阳性患者预后较差，病理级别低、术前KPS评分高、术后放化疗的年轻患者预后相对较好。

2.3 胶质瘤患者预后的单因素分析变量筛选方法：逐一对自变量进行Log-rank检验，计算P值，将P<0.05的变量纳入多因素Cox回归分析(表3，图2)，患者年龄、术前KPS评分、病理级别、术后放化疗、TOPⅡ和IDH1表达满足变量筛选。

图2 Kaplan-Meier生存曲线:A.病理级别与预后的关系；B.术后放化疗与预后的关系；C.TOPⅡ表达与预后的关系；D.IDH1表达与预后的关系

表3 各临床病理特征与胶质瘤患者预后的关系

2.4 影响胶质瘤患者术后预后的多因素回归分析将单因素分析中有意义的临床要素选入多因素分析，以P=0.05水平进行筛查，IDH1阳性、病理级别和术后放化疗严重影响胶质瘤的预后，病理级别分型是胶质瘤预后的危险因素，IDH1阳性、术后放化疗是胶质瘤预后的保护因素(表4)。病理级别高的胶质瘤患者死亡风险是病理级别低患者的5.231倍，而术后放化疗患者的死亡危险是术后无放化疗患者的0.205倍，IDH1阳性患者的死亡风险是IDH1阴性患者的0.388倍。

表4 临床影响因素与患者预后的Cox回归分析

3 讨论

脑胶质瘤的发生、发展是多因素共同参与的复杂过程，其中包含多个细胞因子及癌症基因的共同作用。由于这些细胞因子和癌症基因的异常表达而使肿瘤增殖潜能和疾病预后相应发生变化。因此，探究影响胶质瘤的临床病理因素对早期判断疾病预后和精准治疗有重要的指导意义。因此，本实验通过对胶质瘤患者术后的临床病理资料进行回顾性分析，以探讨TOPⅡ、IDH1在脑胶质瘤中的表达特点及与预后的关系。

DNA TOP是经过催化DNA链的断裂和联合从而控制DNA拓扑状态的一类酶。其位于细胞核内，主要分为TOPI和TOPⅡ，其中TOPⅡ属于同型二聚体蛋白质。其是DNA复制、转录和染色体分离所必需的，与细胞增殖有关，也是抗癌药物的关键靶点[5]。其中TOPⅡa通过各种方式在肿瘤的发展中起重要作用。有研究表明，TOPⅡa产物存在于肿瘤组织中，这些产物可以刺激和促进肿瘤生长、转移和免疫抑制，同时抑制细胞凋亡并导致对化疗的抵抗[6]。这与本组实验得出TOPⅡ阳性患者预后较差的结论一致。TOPⅡa与活跃的细胞增殖有关，同时也是多种化疗药物的分子靶点，其表达水平是影响化疗敏感性的重要因素[7]。临床上应用TOPⅡ靶向药物正是通过干扰DNA和TOPⅡ的结合或增加DNA-TOP共价复合物的浓度来实现的。在常见的细胞毒性药物中，蒽环类药物如阿霉素和依托泊苷是通过结合DNA-TOPⅡa复合物并抑制DNA的再连接起作用的。其能有效干扰TOPⅡ重新连接断裂的DNA双链，破坏其3级结构，从而阻碍DNA复制、转录和RNA合成过程，进而抑制肿瘤细胞生长[8]。霍海波[9]的研究亦发现TOPⅡa高表达，提示体内肿瘤组织增殖活性高，也表明化疗药物对胶质瘤患者较为敏感，化疗效果较好。综合显示，TOPⅡ靶向药物对TOPⅡ高表达患者可能更有效地提高生存期限，延缓生命，同时TOPⅡ基因检测对胶质瘤患者预后预测和临床化疗药物的选择提供有效指导。

IDH是柠檬酸循环的关键酶，在维持机体正常代谢的过程中起到至关重要的作用。近年来在胶质瘤、甲状腺癌、急性髓细胞性白血病等诸多恶性肿瘤中均发现了IDH1和IDH2突变。研究表明IDH1突变作为胶质瘤的生物标志物，可能提示更好的预后[10]。本组实验结果亦显示，IDH1阳性患者中位生存期比阴性患者显著延长，IDH1阳性患者的死亡风险是IDH1阴性患者的0.350倍。这可能与IDH1突变型肿瘤的低增殖率有关。研究表明[11]，IDH1突变能改变机体代谢和细胞结构，其中糖酵解和脂质代谢发生了很多改变，尤其是长链脂酰COA合成酶1(ACSL1)的表达水平较低。癌症基因组图谱提示ACSL1水平越低，IDH1突变胶质瘤患者预后越好[12]。另外，癌症相关的慢性炎症会引发不受控制的血小板活化，导致肿瘤生长、血管生成、转移和癌症相关血栓形成[13]。肿瘤浸润性中性粒细胞增多、外周血中性粒细胞增多和中性粒细胞淋巴细胞比率升高也会导致预后不良[14]。而IDH1突变型胶质瘤通过下调低氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)的表达，炎症水平普遍较低，小血管生成和活化细胞数目减少，生存期往往延长[15]。总之，TOPⅡ和IDH1的表达水平反映了胶质瘤转归的趋势，可以作为判断胶质瘤预后的指标。

影响胶质瘤患者预后的因素较多，本组实验结果表明，术后放化疗和病理级别也是胶质瘤患者预后的影响因素。在肿瘤类型确定的情况下，肿瘤的病理级别越低，异型性就越小，肿瘤的侵袭性和进展性潜能越低，通常疗效反馈越好，相应预后越好。胶质瘤患者术后放化疗可加速术后恢复，延缓病情进展，减少早期肿瘤转移和减缓后期加速进展，从而促进患者康复和延缓生命。这与文中讨论胶质瘤病理级别高的患者死亡风险是病理级别低患者的5.231倍和术后放化疗患者的死亡危险是术后无放化疗患者的0.205倍的结果相符。

综上所述，TOPⅡ和IDH1与胶质瘤病理级别有关，TOPⅡ阳性患者生存期短，IDH1阳性提示预后良好，因此，联合检测TOPⅡ和IDH1有利于判断胶质瘤恶性程度及预测患者生存期，进而为胶质瘤的诊断、预后判定和个性化治疗提供有效的理论依据。