非小细胞肺癌中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化的应用

马晓阳，张 爽，江泽友

肺癌是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤[1]。其中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌中最常见的类型，其侵袭性强，预后差[2]。2011年美国国立癌症研究所研究报道显示，对肺癌高危人群进行低剂量CT检查较普通X线胸片可使肺癌病死率降低20%，但假阳性率高达96.4%[3]。而肺组织活检为侵入性检查，严重肺气肿、出血性疾病及严重凝血功能障碍等患者不宜采用，且肿瘤异质性使局灶取样结果存在偏差[4]。随着基因组学和表观遗传学的深入发展，基因甲基化与肿瘤发生、发展的关系已成为研究热点。甲基供体在DNA甲基转移酶的作用下，将甲基基团转移到DNA上，以CpG二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子上最常见，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)[5]。甲基化的DNA具有更好的稳定性，能够阻止转录因子与之结合，导致基因低表达或不表达[6]。在人类基因组中，约80%的CpG二核苷酸是甲基化的，而20%未甲基化的CpG二核苷酸常位于基因启动子区。研究表明，DNA启动子区异常甲基化在肿瘤中普遍存在，是肿瘤发生过程中最早的变化之一。作者查阅大量相关文献对NSCLC常见甲基化基因进行整理和预试验，最终选择半胱氨酸双加氧酶1(cysteine dioxygenase type 1, CDO1)、Ras相关结构域家族基因1A(Ras association domain family member 1A, RASSF1A)和人矮小同源盒基因2(short stature homeobox 2, SHOX2)三基因进行探究。探索CDO1、RASSF1A和SHOX2在NSCLC中的潜在诊断价值，为NSCLC的早期诊断提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018年1月～2019年4月成都中医药大学附属医院确诊为NSCLC的组织样本55例，同期选取55例肺部良性病变组织样本作为对照组。所有样本均为石蜡包埋组织，并由临床经验丰富的病理医师复查确诊。其中，NSCLC患者男性31例，女性24例，年龄37～80岁，中位年龄60岁。肺部良性病变为气胸和慢性阻塞性肺疾病，其中男性32例，女性23例，年龄18～70岁，中位年龄41岁。所有患者术前均未行放、化疗。

1.2 DNA提纯每个石蜡组织块5～10 μm厚切片5～8张，装入1.5 mL已消毒的离心管中。石蜡组织DNA提取按照石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司)步骤提取DNA，最后以50 μL洗脱液洗脱DNA。用微量紫外-可见光分光光度计(Thermo Scientific公司)测定所提取的DNA浓度。

1.3 亚硫酸盐转化按照EZ DNA Methylation Gold Kit试剂盒(Zymo Research公司)说明书进行操作，每测试投入约500 ng提纯的DNA样本进行亚硫酸盐转换及纯化。最后用30 μL洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱后的DNA立即用于后续试验或置于-20 ℃保存备用。

1.4 定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR, QMSP)采用QMSP技术对CDO1、RASSF1A和SHOX2基因启动子区甲基化进行检测，针对亚硫酸盐转换后的DNA序列设计引物及探针。引物及探针序列、退火温度和产物长度见表1，引物探针由上海生工生物公司合成。PCR反应同时扩增内参基因和待测基因。QMSP反应体系：总体积20 μL，包括2 μL DNA模板(亚硫酸盐转化后)，1×Super Real Pre Mix(天根生化公司)，0.2 μmol/L正、反向引物，0.15 μmol/L Taqman探针，ddH2O补齐至20 μL。PCR扩增循环参数：45个循环，预变性95 ℃ 15 min，变性95 ℃ 3 s，60 ℃退火/延伸20 s。其中，内参基因为ACTB。

表1 QMSP反应引物探针序列、产物长度及退火温度

1.5 结果判断根据临床对于检测灵敏度和特异度的需求分析，判定甲基化基因的截断值Ct值为40，且内参基因的Ct值≤36，测试结果才有效[7]。详细判定方式：(1)ACTB基因的Ct值≤36，甲基化基因Ct值≤40时判断样本为阳性；(2)ACTB基因的Ct值≤36，甲基化基因Ct值>40时判断样本为阴性；(3)ACTB基因的Ct值>36或者无Ct值时，判定样本不合格，不能将其纳入统计。

1.6 统计学分析所有数据采用SPSS 23.0软件进行统计学处理。不同组别间的比较采用χ2检验，甲基化检出率与临床病理特征的相关性分析采用Fisher精确检验法。构建受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)，并计算曲线下面积(area under curve, AUC)。敏感性=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)，特异性=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)。所有P值均取双侧，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化检出率NSCLC组织中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化的检出率分别为85.45%(47/55)、41.82%(23/55)和29.09%(16/55)。对照组中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化的检出率分别为5.45%(3/55)、9.09%(5/55)和3.64%(2/55)。NSCLC组与对照组甲基化检出率相比，CDO1(χ2=70.987，P<0.001)、RASSF1A(χ2=15.523，P<0.001)和SHOX2(χ2=13.019，P<0.001)甲基化在NSCLC中均更易被检测到，差异有统计学意义(图1)。

图1 非小细胞肺癌组和对照组基因甲基化检出率分析：A.CDO1；B.RASSF1A；C.SHOX2；*P<0.001

2.2 CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化与NSCLC临床病理特征的关系NSCLC组织中CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化检出率与患者年龄、性别、组织学类型、分化程度以及TNM分期均无关(P>0.05，表2)。

表2 CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化检出率与非小细胞肺癌临床病理特征的相关性分析[n(%)]

2.3 CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化对NSCLC的诊断价值评估应用ROC曲线评估CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在NSCLC中的诊断价值。CDO1基因甲基化区分NSCLC组和对照组的AUC为0.920 0(95%CI=0.861 7～0.978 3，P<0.001)，敏感性为85.45%(95%CI=72.78%～93.07%)，特异性为94.55%(95%CI=83.93%～98.58%)；RASSF1A基因甲基化区分NSCLC组和对照组的AUC为0.672 1(95%CI=0.570 4～0.773 7，P=0.002)，敏感性为41.82%(95%CI=28.93%～55.85%)，特异性为90.91%(95%CI=79.29%～96.60%)；SHOX2基因甲基化区分NSCLC组和对照组的AUC为0.641 5(95%CI=0.537 4～0.745 6，P=0.011)，敏感性为29.09%(95%CI=18.02%～43.09%)，特异性为96.36%(95%CI=86.39%～99.37%)(图2)。

图2 CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在非小细胞肺癌中的诊断价值：A.CDO1；B.RASSF1A；C.SHOX2

3 讨论

肺癌是全球肿瘤相关死亡的主要原因，其中约85%的确诊病例为NSCLC，组织学类型主要包括腺癌和鳞癌[8]。NSCLC目前缺乏理想的早期筛查手段，故寻找敏感且特异的NSCLC早期诊断标志物对降低肺癌患者的病死率具有重要的临床意义。随着基因检测技术的发展，分子标志物被广泛应用于肿瘤临床诊断、精准治疗和预后评估。研究表明基因甲基化在肿瘤中具有普遍性和早期性，因此基因甲基化是早期诊断肿瘤的理想分子标志物[9]。此前，已有许多研究者在NSCLC患者的痰液、支气管肺泡灌洗液和血清中检测到基因启动子区CpG岛高度甲基化[10-12]。与传统的蛋白标志物相比，基因甲基化具有更高的敏感性和特异性，提示基因甲基化有望成为筛查NSCLC的分子标志物。目前已有大量文献报道CDO1、RASSF1A和SHOX2在肺癌、乳腺癌、结直肠癌及口腔癌等多种肿瘤中存在表达失活，且启动子区高度甲基化是其功能失活的主要机制[13-16]。CDO1基因位于染色体5q23.2处，编码一种非血红素结构的含铁金属酶，可调节半胱氨酸与谷胱甘肽的合成。CDO1是牛磺酸生物合成途径的关键酶之一，对牛磺酸的生物合成起关键作用[17]。RASSF1A基因位于3p21.3，是Ras信号通路的成员，参与细胞周期调节和诱导细胞凋亡等细胞生理功能[18]。研究显示，RASSF1A表达减少在大鼠肺腺癌的发生发展中起重要作用[19]。SHOX2基因定位于3q25-q26.1，编码含有60个氨基酸残基的DNA结合结构域，是一种转录调节因子。本实验主要分析CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在NSCLC组织中的检出率，从而寻找适合NSCLC早期筛查的分子标志物，为后续研究奠定基础。

本实验采用QMSP法检测CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在NSCLC组和对照组中的发生情况，结果显示CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化在NSCLC组中的检出率分别为85.45%(47/55)、41.82%(23/55)和29.09%(16/55)；在对照组中的检出率分别为5.45%(3/55)、9.09%(5/55)和3.64%(2/55)，差异均有统计学意义(P<0.05)。因此CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化是肿瘤相关或肿瘤特异性的，提示其可能在NSCLC的发生发展中起重要作用，同时为靶向治疗的研究提供新思路和新方向。此外，CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化检出率与NSCLC患者年龄、性别、组织学类型、分化程度以及TNM分期均无关(P>0.05)，说明CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化可能是NSCLC发生的早期事件，而与NSCLC的进展无关。CDO1基因甲基化区分NSCLC组和对照组的AUC为0.920 0，敏感性为85.45%，特异性为94.55%；RASSF1A基因甲基化区分NSCLC组和对照组的AUC为0.672 1，敏感性为41.82%，特异性为90.91%；SHOX2基因甲基化区分NSCLC组和对照组的AUC为0.641 5，敏感性为29.09%，特异性为96.36%。因此，CDO1基因甲基化是筛查NSCLC的更有效的潜在分子标志物，可为NSCLC的早期诊断提供新手段。

QMSP法是以特异性的引物和探针检测基因CpG岛的胞嘧啶是否发生甲基化。该方法检测结果准确、灵敏度高，与Sanger测序结果呈高度一致性[11]。QMSP也被称为Methylight，是一种依赖亚硫酸盐转换和基于实时荧光定量的PCR方法[20]。QMSP的原理是利用亚硫酸盐使未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，在PCR扩增过程中，再转换为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。因此针对修饰前后的序列差异设计特异性引物和探针从而实现区分甲基化和未甲基化的序列。QMSP方法方便简单，在PCR反应后无需任何操作即可快速判断，适用于大量样本的快速检测和临床体外诊断。

综上，CDO1、RASSF1A和SHOX2基因甲基化对NSCLC均具有一定的诊断价值，但CDO1基因甲基化是筛查NSCLC更有效的潜在分子标志物，故CDO1基因甲基化是课题组未来研究的核心方向。由于获得支气管肺泡灌洗液对患者创伤性较小以及诊断肺部疾病的敏感性和特异性高，后续实验会将本组结果应用到支气管肺泡灌洗液，进一步探讨CDO1基因甲基化在NSCLC中的早期诊断价值。