三种糖品中植物甾醇的测定

陈其钊，林燕纯，刘志鹏*，陈嘉敏，李长成，王桂华，李家威，余构彬

1(广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)国家糖业质量监督检验中心，广东 广州，510316) 2(汕头普罗凯融生物医药科技有限公司，广东 汕头，515000)

红糖产品(红糖，黑糖，赤砂糖)因其保留了甘蔗原有的风味和营养物质(蛋白质，矿物质，维生素，酚类物质，有机酸，植物甾醇等非糖成分)，符合天然健康的饮食观念[1-2]，享有健脾养胃、温中补气、缓解精通的温补美誉，深受消费者喜爱。国内外学者研究发现，其保健功能物质基础可能与红糖产品中的非糖成分有密切关系[3-9]。甘蔗甾醇含量高，抗炎、降血脂、缓解非酒精性脂肪肝化能力强[10-13]，红糖作为甘蔗全汁浓缩物，甘蔗甾醇在传统提取浓缩工艺中自然进入红糖产品，但目前对传统工艺红糖产品的甾醇类成分研究报道较少。为探讨传统红糖的保健功能及机制，了解红糖产品中甾醇的含量及其在加工过程中的变化,本文建立了一种高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定红糖产品中5种植物甾醇含量的方法，并对红糖产品中3种常见的甾醇含量进行了分析测定,以期为红糖产品的深入开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1290)，安捷伦科技(中国)有限公司；旋转蒸发仪(IKA RV8)、旋涡混合器(VORTEX 3)，艾卡(广州)仪器设备有限公司；恒温水浴锅(DKZ-2B)，上海一恒科技有限公司；医用离心机(CL5R)，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Milli-Q超纯水系统，默克密理博公司。

甲醇、乙腈(色谱纯)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、KOH，无水乙醇(分析纯)，广州化学试剂有限公司。

色谱柱 Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；Waters ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；ZORBAX SB C8RRHD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)

标准物质：麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇、β谷甾醇和菜油甾醇(纯度≥95%)，上海安谱实验科技股份有限公司。

96批次食糖样品均来自2017～2019年广东、广西、云南3个不同产地，其中41个红糖样品，11个黑糖样品，44个赤砂糖样品。在分析之前，所有食糖样品都储存在塑料罐中，阴凉避光保存。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件：

Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)液相色谱柱；检测波长205 nm(β-谷甾醇，菜油甾醇，胆甾醇和豆甾醇最大吸收波长)，282 nm(麦角甾醇最大吸收波长)；流速0.4 mL/min；柱温35 ℃；进样量5 μL。流动相：A相为水，B相为乙腈；采用梯度洗脱，0～9.5 min 80%～90% B相。

1.2.2 供试品溶液的制备

取约3.0 g样品置于锥形瓶中，加入无水乙醇溶液旋涡提取30 min，以体积比1∶1加入50%(质量分数)NaOH溶液，摇匀，在80 ℃水浴中皂化60 min，冷却后加入水10 mL，并移入分液漏斗中，用15 mL二氯甲烷分3次萃取，合并萃取液，旋干，用甲醇2 mL复溶，用0.22 μm微孔滤膜过滤，用于HPLC进样。

1.2.3 标准溶液的配制

分别称取适量麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇、β谷甾醇和菜油甾醇，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分别制成约1.0 mg/mL的储备液，于4 ℃下避光储存备用。取适量部分上述标准储备液用甲醇配制成质量浓度为0.1～100 ng/mL系列标准工作液。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1 检测波长选择

在190～400 nm下分别对5种甾醇标准溶液进行紫外扫描，发现麦角甾醇的最大吸收波长为282 nm，胆甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和β-谷甾醇在205 nm处有最强吸收(见图1)，因此麦角甾醇的检测波长选择282 nm，胆甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和β-谷甾醇的检测波长选择205 nm。

A-麦角甾醇；B-胆甾醇；C-菜油甾醇； D-豆甾醇；E-β-谷甾醇图1 5种植物甾醇的吸收光谱图(扫描波长190～640 nm)Fig.1 Adsorption chromatography of 5 phytosterols

2.1.2 色谱柱选择

尝试了安捷伦ZORBAX SB C8RRHD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，Waters ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)三款色谱柱。发现C18对4种成分的分离效果好，但是运行比较长，在超高效色谱系统需要28 min才能完全出峰。不同牌子的C8色谱柱对于分离情况也有区别，相同流动相，相同梯度下ZORBAX SB C8RRHD柱不能分离菜油甾醇和豆甾醇，Waters ACQUITY UPLC BEH C8则能实现8 min内5种成分完全分离。

2.1.3 流动相选择

流动相：甲醇截止波长为205 nm;乙腈截止波长为190 nm，而胆甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和β-谷甾醇的最大吸收波长为205 nm，在甲醇水系统下，基线漂移严重。故选择乙腈水作为流动相。尝试了乙腈-水100∶0、98∶2、95∶5、90∶10、80∶20(体积比)等多种等度洗脱，均无法实现菜油甾醇和豆甾醇的分离。梯度洗脱：0～9.5 min乙腈80%～90%，则能5种成分完全基线分离；流速，柱温对峰位和组分分离影响不大。在此条件下菜籽甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇分离情况良好，满足定量分析要求，见图2、图3。

A-205 nm；B-282 nm；1-麦角甾醇;2-胆甾醇;3-菜油甾醇;4-豆甾醇;5-β-谷甾醇图2 标准色谱图Fig.2 Chromatogram of standard

A-205 nm；B-282 nm；1-麦角甾醇;2-胆甾醇;3-菜油甾醇;4-豆甾醇;5-β-谷甾醇图3 样品色谱图Fig.3 Chromatogram of sample

2.1.4 提取方法的优化

文献报道的提取方法大多数使用回流皂化，溶剂萃取再浓缩，耗费时间比较长，操作复杂[10-13]。也有针对样品基质比较简单的，仅需超声或涡旋提取，皂化即得[14-20]。因为糖品的基质较简单，所以本文也采用直接提取皂化法。前期在文献总结的基础上运用响应面法对超声提取时间、料液比、皂化时间和萃取次数进行实验探究和优化，得到5种甾醇的提取工艺条件为：料液比为1∶10，提取时间为19.58 min，皂化时间1 h，萃取次数3次，提取总量预测为20.012 μg。对预测的最佳工艺条件进行了验证并结合实际操作，将验证条件修正为料液比为1∶10，提取时间为20 min，皂化时间1 h，萃取次数3次。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围

精密吸取混合对照品储备液一定体积，按倍数关系稀释成不同质量浓度的标准溶液进行测定，采用优化后的前处理方法以及色谱条件，以5种甾醇色谱峰的峰面积平均值(Y)为纵坐标，对应的标准溶液浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线；以信噪比S/N=3确定仪器检出限。结果如表1所示，5种植物甾醇在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数均不小于0.999 7；麦角甾醇检出限均为0.023 mg/kg，胆甾醇为0.14 mg/kg，菜油甾醇为0.18 mg/kg，豆甾醇为0.11 mg/kg，β-谷甾醇为0.17 mg/kg，方法灵敏度较高，可满足糖品中甾醇检测需要。

表1 方法的线性范围、回归方程及检出限Table 1 Linear range，linear equations and limits of detection of the method

2.2.2 精密度试验

取供试品溶液按照1.2.1项下色谱条件连续进样6次，结果显示，麦角甾醇、胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇峰面积的精密度(相对标准偏差)分别为1.6%、3.9%、1.3%、0.20%、0.29%表明仪器的精密度良好。

2.2.3 加标回收率

精确称取红糖样品3.0 g，按重复性结果计算得到5个甾醇成分的含量，分别加入3个水平的对照品，在最佳提取条件及色谱条件下，每一浓度平行3次测定红糖中植物甾醇的回收率，结果见表2。由表2可知，红糖中麦角甾醇的平均回收率为74.4%～95.8%，胆甾醇的平均回收率为82.3%～91.4%，菜油甾醇的平均回收率为84.6%～102.5%，豆甾醇的回收率为88.0%～92.1%，β-谷甾醇的回收率为75.4%～92.6%。

表2 方法的回收率(n=6)Table 2 Recovery of the method(n=6)

2.3 样品含量测定与聚类分析

2.3.1 样品含量测定

取96批不同产地和级别的红糖，黑糖和赤砂糖样品按优化后的最佳提取条件和最优色谱条件进行含量测定，按2.4.1中的线性方程计算麦角甾醇、胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的含量，结果见表3。由表3可知，所测96个样品中大部分含有5种植物甾醇。5种植物甾醇以豆甾醇和β-谷甾醇含量较高，可达244.41 mg/kg、67.38 mg/kg，麦角甾醇含量最低。

3种糖品中平均总甾醇含量差异明显，分布为红糖>黑糖>赤砂糖。GB/T 35886—2018[21]食糖分类中提到，红糖是糖汁清净处理后直接炼煮不经分蜜制成。而赤砂糖则是经过了分蜜制成，是工业化生产白砂糖的副产品。目前还没有黑糖的国家标准，据DB 4413/T 10—2019[22]和QB/T 4567—2013[23]描述其生产工艺与红糖相似，只是炼煮的颜色差异。因此总甾醇含量差异可能与3种糖品的生产工艺或产地有关，但还需进一步分析研究。

从糖品的等级上看，无论红糖的优级、一级和二级还是赤砂糖的一、二级，在总甾醇含量上并没有多大区分。

表3 实际样品的测定结果 单位：mg/kg

2.3.2 聚类分析

综合不同产地和级别的糖品中麦角甾醇、胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的含量和甾醇总含量这6个指标，借助SPSS软件并采用系统聚类法中的Ward 联结和平方Euclidean距离系数对红糖，黑糖，赤砂糖样品进行聚类分析，结果如图4～图6所示。

图4 红糖聚类分析树状图Fig.4 Brown sugar cluster analysis dendrogram

图5 黑糖聚类分析树状图Fig.5 Dark brown sugarcluster analysis dendrogram

图6 赤砂糖聚类分析树状图Fig.6 Brown granulated suga rcluster analysis dendrogram

由图4可知，41个红糖样品可分为四大类。第一类为2、18～25、27、31、33、35～37号样品，第二类为1、4、6、7、14、16、26、28、29、30、32、34号样品，第三类为3、5、8、9、11～13、15、17、38～41号样品；10号样品与其他样品间距较大，分一类。

由图5可知，11个黑糖样品可分为三大类。第一类为44～47、50～52号样品，第二类为42、49号样品，第三类为43、48号样品；

由图6可知，44个赤砂糖样品可分为五大类。第一类为53～56、59～60、62、64、67、70、72～79、82、84～86、88、91、94、96号样品，第二类为71、83、92～93号样品，第三类为61、63、65、69、80、81、87、89、90、95号样品；第四类为58、66、68号样品；57号样品与其他样品间距较大，分为一类。

3 结论

本文通过对3种糖品的前处理和色谱条件的优化，建立了超高效液相色谱法同时测定红糖中麦角甾醇、胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇这5种植物甾醇的方法。对3种糖品96个样本中5种植物甾醇的含量进行检测，结果发现其中5种植物甾醇以豆甾醇和β-谷甾醇含量较高，麦角甾醇含量最低，不同糖品中总甾醇成分含量差异较大，分布为红糖>黑糖>赤砂糖。植物甾醇作为具有一定药用价值的成分，研究其在红糖产品中的含量可为其产品质量标准的提高提供参考，为其合理开发利用奠定基础。