基于银纳米颗粒局域表面等离子体共振散射特性测定多巴胺

邹明静 丁冠闻 李志莹 刘晓松 马先鑫

摘      要： 在pH=5.91的Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，多巴胺通过静电作用使银纳米颗粒聚集，导致其局域表面等离子体共振性质改变，使体系的共振光散射强度显著增强。当多巴胺质量浓度在0.002～0.80 μg·mL-1之间时，共振光散射强度的增强值ΔI490nm与多巴胺的质量浓度呈现出良好的线性关系，可得线性方程为ΔI490nm=   1 092.5ρ+6.25，检出限（3σ）为0.2 ng·mL-1，据此建立了一种快速、简便检测多巴胺新方法。已将本方法用于市售盐酸多巴胺注射液的检测，并与高效液相色谱法检测结果比较，测定结果可靠。

关  键  词：银纳米颗粒;多巴胺;局域表面等离子体共振;散射

中图分类号：O657.39       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）09-1880-04

Abstract： In pH=5.91 Na2HPO4-KH2PO4 buffer solution， silver nanoparticles were aggregated by the electrostatic interaction between dopamine and silver nanoparticles， so the surface plasmon resonance properties of silver nanoparticles were changed and the resonance light scattering intensity at 490 nm enhanced greatly. There was a good linear relationship between the intensity ΔI490nm and the mass concentration of dopamine in the range of 0.002～0.80 μg·mL-1， with the calibration equation of ΔI490nm=1 092.5ρ+6.25 and its detection limit of 0.2 ng·mL-1 （3σ）. Owing to its speediness and simplicity， the method was applied in the determination of dopamine hydrochloride injection， the determination results were compared with that by determined high performance liquid chromatography. The results have proved that the method is reliable.

Key words： Silver nanoparticles; Dopamine; Local surface plasma resonance; Scattering

多巴胺（DA）為人脑所分泌的一种神经递质，其可参与调节人体心血管、肾脏、内分泌和中枢神经系统的各项生理活动，若人体DA分泌失调可能诱发心脏病、帕金森病、精神分裂症和癫痫病等疾病[1-3]。而且，人工合成DA可作为药物用于心肌梗死、肾功能衰竭和感染性昏迷等症状的治疗[4-5]。因此，构建DA快捷、简便的检测方法可为其生理功能研究和相关疾病的临床诊断治疗提供参考，具有重要的临床意义，目前其常用的测定方法主要有电化学方法、荧光光度法和高效液相色谱法等。电化学方法应用较为广泛，通常利用DA酚羟基的电化学活性进行定量检测，但由于DA易在金、铂等裸电极表面下形成较高过电位导致该类方法灵敏度较低，近年来发展的化学修饰电极较好克服了DA过电位高的不足，但该类方法电极修饰过程仍较为复杂[6-7]。荧光法常采用量子点与DA相互作用而产生荧光信号变化，该类方法检测灵敏度高，但仍存在荧光猝灭的问题[8-9]。高效液相色谱法常用于复杂样本中DA的分离分析，方法可靠，但该方法因仪器昂贵且耗时导致检测成本较高，其应用易受到限  制[10]。

近年来研究发现，金属纳米颗粒可因特定物质或反应的诱导发生聚集，其颗粒间距离的变化则导致其原有的表面等离子体共振性质改变，并由此产生显著增强的光散射信号[11-14]。其中，金属银纳米颗粒因其具有的等离子体共振散射特性已被应用于药物小分子检测、氨基酸、蛋白质和核酸分析等领域[15-18]。故本文基于银纳米颗粒的表面等离子体共振散射特性，构建了一种测定DA的新方法，用于盐酸多巴胺注射液的分析，并与高效液相色谱方法对照，检测结果可靠。

1  实验部分

1.1  仪器和试剂

纳米粒度与Zeta电位分析仪，Zetasizer Nano ZSE，Malvern;磁力加热搅拌器，TP-350S，杭州米欧;荧光分光光度计，CRT970，上海精密;高效液相色谱仪，LC-20AT，Shimadzu;紫外-可见分光光度计，UV2100，北京瑞利;轨道式摇床，GS-20，杭州米欧;超纯水仪，上海芷昂。

盐酸多巴胺，Sigma;10 mg·mL-1硝酸银，上海国药;10 mg·mL-1柠檬酸钠，上海国药; 0.005 mol·L-1十二烷基硫酸钠，上海国药; 4-乙基邻苯二酚，Aladdin;乙腈，西陇化工;冰乙酸，上海国药;     0.1 mol·L-1乙二胺四乙酸二钠，上海国药;Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液：准确移取KH2PO4溶液（0.067 mol·L-1）与KH2PO4溶液（0.067 mol·L-1）并按一定比例混匀;实验均采用符合18.2 M?·cm纯水。

1.2   方法

合成银纳米颗粒：移取100 mL超纯水至锥形瓶中，准确加入新鲜配制0.35 mg·mL-1 AgNO3溶液4.00 mL，加热至沸腾。在磁力加热搅拌作用下，缓慢加入2.00 mL 10 mg·mL-1柠檬酸钠溶液，加速搅拌并保持沸腾30 min。将制备的银胶溶液自然冷却，定容至100 mL，4 ℃保存，通过动态光散射测定银纳米颗粒的粒径。

在5 mL比色管中，依次加入0.50 mL pH=5.91 Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液、盐酸DA标准溶液、  2.25 mL银胶溶液，准确稀释至5.00 mL，混匀，室温反应15 min后扫描体系的紫外-可见吸收光谱和共振光散射光谱。共振光散射光谱扫描条件：在荧光分光光度计工作界面设置λex=λem，灵敏度2，同步扫描，选择490 nm作为测定波长。

2  结果与讨论

采用柠檬酸钠还原法合成的银纳米颗粒表面被柠檬酸根包被而带负电。若控制适宜的pH条件，DA盐酸盐在溶液中可带正电，其可通过静电作用诱使带负电的银纳米颗粒聚集，聚集现象的发生改变了银纳米颗粒的局域表面等离子体共振性质，使体系共振光散射增强，据此通过检测体系的共振光散射信号变化可建立DA检测的新方法。

2.1  动态光散射

以柠檬酸还原法获得银纳米颗粒平均粒径约为6 nm，如图1（a）所示。当DA与银纳米颗粒相互作用后，其粒径约为110 nm，见图1（b）。结果表明，在适宜的pH条件下，DA诱使银纳米颗粒发生聚集。

2.2  吸收光谱

银胶溶液呈澄清亮黄色，在420 nm处存在表面等离子体共振吸收，随DA加入量逐渐增加时，在420 nm处的吸收峰强度值逐渐减弱（图2），体系溶液的颜色亮黄色至棕黄色。结果表明，当银纳米颗粒在DA作用下发生聚集后，其局域等离子体共振吸收被抑制。

2.3  共振光散射光谱

DA盐酸盐溶液仅有微弱的共振光散射信号。银胶溶液在490 nm处存在较弱的共振光散射信号。当在银胶溶液中加入DA溶液后，随DA加入量逐渐增加时，体系在490 nm处的共振光散射强度显著增强（图3）。结果表明，DA通过静电作用诱使银纳米颗粒聚集，其局域表面等离子体共振性质改变可使体系的等离子体共振散射增强。本文选择了490 nm的共振光散射强度用于后续测定。

2.4  实验条件的选择

2.4.1  优化缓冲条件

实验考察了pH=4.49～6.98 Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液对体系ΔI490nm的影响。实验表明，体系的   ΔI490nm在pH=4.92～6.47 Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中均较为稳定，当pH=5.91时，体系ΔI490nm最大（图4）。故选用pH=5.91 Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液，在本实验中加入该pH值缓冲溶液0.50 mL。

2.4.2  优化银胶溶液用量

银胶溶液用量对体系ΔI490nm影响如图5。结果表明，在一定质量浓度范围内，ΔI490nm随银胶溶液加入量的增加而相应增强。当银胶溶液用量在2.00～2.50 mL（ρAg=5.53～6.91 μg·mL-1）时，ΔI490nm较大。本文选择了2.25 mL银胶溶液，即 6.22 μg·mL-1银胶溶液。

2.4.3  优化实验温度与反应时间

考察了实验温度和反应时间对体系ΔI490nm的影响。选择了10、20、30、40 ℃分别进行实验。实验发现，在10～40 ℃温度条件下，体系ΔI490nm均能在10 min后即趋于稳定。由于温度对该反应体系影响较小，本文选在室温条件下，于摇床振荡反应15 min 后用于测定。

2.4.4  工作曲线

按照优化后的最佳实验条件，测定不同DA质量浓度相应的ΔI490nm，ΔI490nm= I490nm – （I490nm）b，以DA质量浓度ρ对ΔI490nm作图，DA在0.002～0.80 μg·mL-1范围内与共振光散射强度增强值ΔI490 nm线性相关，其方程为ΔI490nm=1 092.5ρ+6.25，相關系数R=0.993 2，检出限（3δ）为0. 2 ng·mL-1，该方法可灵敏检测DA。

2.4.5  方法选择性

在测定0.40 μg·mL-1 DA时，控制相对误差在±10%之间，考察方法的选择性，100倍葡萄糖、叶酸、维生素C、蔗糖、Na+、Mn2+、K+、Zn2+、Ca2+对测定无明显干扰，该方法的选择性良好。

2.5  样品测定

准备不同药业公司生产的盐酸多巴胺注射液，分别移取100 μL注射液至100 mL容量瓶并准确定容，即为DA稀释液。取200 μL DA稀释液按本法测定，并采用高效液相色谱法（HPLC法）作为对照方法[19]，测定结果一致（表1）。对盐酸多巴胺注射液采用标准加入法进行回收试验，测得回收率在98.3%～105.0%之间，如表2所示。样品分析及回收试验均表明，该法用于测定盐酸多巴胺注射液中DA质量浓度准确可靠。

3  结 论

DA与银纳米颗粒体系的共振光散射光谱、吸收光谱及动态光散射变化均证实，合适的pH缓冲环境可使DA带正电，与带负电的银纳米颗粒发生静电吸引作用可使银纳米颗粒聚集。聚集现象的发生使银纳米颗粒原有的局域表面等离子体共振性质被改变，其等离子体共振吸收被抑制而等离子体共振散射则增强，故体系在490 nm产生了显著的共振散射光信号，且散射光强度增强值与DA质量浓度呈现线性相关，其已用于盐酸多巴胺注射液的检测，并进行了方法对照和加标回收试验，测定结果可靠，建立了通过共振光散射光谱测定DA注射液的新方法。

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