猪场环境中苍蝇携带的PRRSV NSP2 及ORF5 基因遗传特征差异性分析

冯晓慧 ，单栢强 ，崔月娀 ，魏 澍 ，张 飞 ，沈国顺 ，刘金玲

（1.沈阳农业大学 畜牧兽医学院，沈阳 110161；2.辽宁省动物疫病预防控制中心，沈阳 110164）

猪繁殖与呼吸综合征 （porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS） 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起的一种猪的全球性疫病，给养猪业造成了严重的经济损失，以妊娠母猪和初生仔猪最易感[1-2]。 PRRSV 分两种基因型：Lelystad virus 代表的欧洲型和VR2332代表的北美洲型， 两者在核苷酸水平上有明显的异性。 PRRSV 属于Nidovitales、Arteriviridae 家族的Arterivirus属，基因组片段长约 15 kb，包含 8 个 ORFs，从 5’端到 3’端依次为 ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF 3-7 和新发现的ORF5a，其中ORF1a 和ORF1b 占基因组全长的2/3，ORF1a 和ORF1b 分别编码多蛋白酶，pp1a 和pp1ab，参与病毒复制[3]。pp1a 可以产生至少 11 个非结构蛋白，如 NSP1a、NSP1β、NSP2、NSP2 TF 等。ORF5-7 分别编码病毒的结构蛋白GP5、M、N[4]。NSP2 编码PRRSV 基因组中最大的非结构蛋白。由N-端半胱氨酸蛋白酶、中间的高变区、C-端的跨膜区域、C-端末尾保守功能区域组成[5]。NSP2 在病毒复制中与NSP3 共同参与双层膜泡结构的形成[6-7]。GP5 蛋白是PRRSV 最主要的免疫原性蛋白，可诱导机体产生中和抗体引起一系列细胞免疫反应。此外，PRRSV 具有遗传多样性的特点，可通过突变、缺失、重组等方式产生新的致病性强的病毒[8-10]。 严重危害养猪业的健康生长。 ORF5 和NSP2 是PRRSV 基因组的高度可变区域， 可作为研究PRRSV 变异和遗传多样性的首选基因，欧洲型和美洲型ORF5 基因氨基酸同源性为55%，具有较高的差异。

易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉及子宫内接种等多种途径而感染PRRSV，从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。 易感猪与带毒猪直接接触或与污染了PRRSV 的运输工具、器械接触也可感染PRRS。 此外，国内外学者在研究PRRSV 传播途径中发现，将赫眼家蝇和红眼家蝇放入感染了PRRSV 的猪舍，重新捕获、洗涤后通过RT-PCR 在苍蝇样品中检测到了具有感染性的PRRSV[11]。 相关研究还发现，苍蝇不仅能够感染PRRSV，并且能够携带PRRSV 传播至1．7km 并传染给易感猪。苍蝇的飞行传播恰好解释了PRRSV 在农场之间传播具有季节性的特点[11-12]。 为了解媒介飞行昆虫传播病原的分子生物学特点，有效预测和控制疫情传播，本试验通过收集PRRSV 阳性猪场环境中的苍蝇和发病猪的淋巴结， 洗涤后分别提取核酸， 采用RT-PCR 方法， 检测PRRSV NSP2、ORF5 基因，利用生物信息学软件分析猪源和苍蝇源PRRSV NSP2 和ORF5 基因的遗传特性，比较二者间的差异，以期为初步评估环境飞行昆虫媒介传播PRRSV 的潜在风险提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

TrizoL 购自invitrogen 公司；CCL3、 无水乙醇购自天津市富宇精细化工有限公司；DHPC 处理水购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖（APLHGHN CA94107）购自Gel 公司；反转录试剂盒（RR047A）购自Takara 宝生物工程（大连）有限公司等。

1.2 样品采集

2018 年7～8 月选取8 个沈阳周边PRRSV 阳性猪场，每个猪场采集PRRSV 病猪的淋巴结2～3 份，捕蝇器收集猪舍环境中的苍蝇，每个猪场10～30 只苍蝇样本。

1.3 设计引物与合成

根据NCBI GenBank 登录号的PRRSV 基因序列，采用Primer 软件设计PRRSV NSP2（可区分高致病及低致病性毒株）和ORF5 基因特异性引物。 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PRRSV 的基因片段Table 1 PRRSV gene fragments

1.4 苍蝇和猪淋巴组织RNA 的提取

取8～10 只经形态学鉴定主要以腐生生活方式为主的舍蝇和适量猪场病猪淋巴组织，用生理盐水反复清洗，分别用液氮研磨成粉沫， 置于1．5mL 除酶离心管， 加入1mL Trizol， 混匀静置10min 后再加入200μL 氯仿静置5min，4℃ 12000r·min-1离心 15min，吸取 400μL 上清水相放入新的 1．5mL 除酶离心管，再加入 500μL 异丙醇颠倒混匀，静置 10min 后 4℃ 10000r·min-1离心 10min，弃上清后加 1mL 预冷的 75%无 RNase 乙醇，4℃ 8000r·min-1离心 5min，弃液体，加 20μL RNA 溶解水，测定浓度，-80℃备用。

1.5 苍蝇和猪淋巴组织中PRRSV 的RT-PCR

为保证上样模板量的一致性，将测完浓度的苍蝇源和猪源RNA 样本稀释至相同浓度，参考反转录试剂盒操作流程制备 cDNA：去除混有的 DNA 后依次加入 Random hexamers 1 μL，2×RT Mix 10μL，Oligo（dT）23VN 1μL，Hiscript Ⅱ Hnzyme Mix 2μL，RNA 模版为含 1 μg 总 RNA 对应体积，RNase free dd H2O 添加至 20μL。 25℃ 5min、50℃ 45min、85℃ 2min 反应后-20℃保存。

PCR 反应：取苍蝇源和猪源 cDNA 模板各 1μL，分别依次加入上下游引物各 0．4μL，RNase free ddH2O 3．2μL，HxTaqDNA 酶 5μL，总体积为 10μL。 PRRSV NSP2 基因扩增条件：94℃预热 2min 后按 94℃ 30s，54℃ 30s，72℃30s，扩增 30 个循环；72℃延伸 2min。 PRRSV ORF5 基因扩增条件：94℃预热 2min 后按 94℃ 30s；55℃ 30s；72℃30s；扩增 30 个循环；72℃延伸 2min。PRRSV ORF5 基因套式 PCR 扩增条件：以苍蝇源 PRRSV 的 ORF5 第一次RT-PCR 产物为模板，进行二次RT-PCR，反应体系同上。1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外光下观察目的基因条带。

1.6 苍蝇和猪淋巴组织中PRRSV NSP2 和ORF5 基因序列测定及生物信息学分析

将苍蝇源和猪源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因的RT-PCR 产物送上海生工测序。 运用DNASTAR、Fig tree、MHGA 等生物信息软件将获得的PRRSV NSP2 和ORF5 基因序列与GenBank 登陆的PRRSV 代表毒株进行核苷酸、氨基酸序列的同源性分析并构建系统遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 苍蝇和猪淋巴组织PRRSV NSP2 和ORF5 基因的RT-PCR 扩增结果

采用1．0%琼脂糖凝胶对苍蝇源和猪源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因RT-PCR 产物进行电泳， 在凝胶成像系统中检测。 结果表明，猪源和苍蝇源PRRSV 的NSP2 基因产物均在250bp 出现目的片段， 苍蝇源和猪源PRRSV的ORF5 基因套式PCR 产物分别在258bp 和385bp 出现目的片段，与预期片段长度一致（图1）。

2.2 苍蝇源PRRSV 与猪源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因核苷酸与氨基酸同源性分析

采用DNAStar 软件对苍蝇源PRRSV 与猪场猪源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因分别进行核苷酸与氨基酸序列分析。 结果表明，苍蝇源PRRSV NSP2 基因与猪源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 基因核苷酸同源性为 45．9%～95．9%，氨基酸同源性为 33%～92．9%。 苍蝇源PRRSV ORF5 基因与猪源以及其他 PRRSV 代表株ORF5 基因核苷酸同源性为 61．5%～95．2%， 氨基酸同源性为 32．5%～90．9%。 综上表明，苍蝇源 PRRSV 与猪源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因在核苷酸和氨基酸序列上均存在不同程度的差异。 其中苍蝇源PRRSV NSP2 基因与PRRSV VR2332 代表株核苷酸的差异最大，同源性为45．9%，与猪场猪源PRRSV 的差异最小，二者同源性为95．9%，其次是PRRSV GD 代表株为93．9%。 此外，苍蝇源PRRSV NSP2 基因与PRRSV LV 代表株氨基酸同源性最低为33%，与猪场猪源PRRSV 同源性为92．9%。 另一方面，苍蝇源PRRSV ORF5 基因与PRRSV LV 代表株核苷酸同源性最低为61．5%，与PRRSV GX1003、15SC1、GD 代表株的同源性为94．8%，并且与PRRSVHurope 代表株氨基酸序列差异最大，同源性仅为为32．5%，与PRRSV GD 代表株的差异最小同源性为90．9%(图2)。

图1 苍蝇源和猪场猪源PRRSV NSP2 和ORF5 基因RT-PCR 产物电泳分析图Figure 1 RT-PCR electrophoresis maps of PRRSV NSP2 and ORF5 genes from flies and pigs in the farms

图2 苍蝇源、猪场猪源和其他PRRSV 代表株 NSP2、ORF5 基因序列同源性分析Figure 2 Homology analysis of NSP2 and ORF5 genes of PRRSV from flies , pigs and the other representative strains

2.3 苍蝇源PRRSV 与猪源以及其他PRRSV 代表株NSP2 和ORF5 基因差异氨基酸位点分析

苍蝇源PRRSV 与猪场猪源以及其他PRRSV 代表株NSP2 基因编码的氨基酸序列比对结果表明， 苍蝇源PRRSV 的NSP2 基因在第472 位氨基酸存在缺失，第529 位发生529Arg→Lys 替换；与其他PRRSV 代表株SH1-GD、ZJ2、FZ06A、Hanvet1．vn、HNxa14 相比，苍蝇源和猪场猪源 PRRSV 的 NSP2 基因均在第 469 位氨基酸插入 1个Met，其余氨基酸序列与PRRSV 代表株一致，同样在480-481 位氨基酸出现缺失(图3)。

图3 苍蝇源猪场猪源以及其他PRRSV 代表株NSP2 基因氨基酸差异位点分析Figure 3 Different site analysis of amino acid for PRRSV NSP2 genes from flies, pigs and the other representative strains

苍蝇源PRRSV 与猪场猪源以及其他PRRSV 代表株的ORF5 基因编码的氨基酸序列比对结果显示，苍蝇源PRRSV ORF5 基因的第 16，20，92 位氨基酸缺失，第 33，59，88，90 位氨基酸分别出现 33Asp→Asn、59Asn→Lys、88Pro→Leu、90His→Arg 替换，第 82 位有 1 个 Leu 的插入。而猪场猪源 PRRSV ORF5 基因与其他 PRRSV 代表株GX1001、Hanvet1．vn、JXA1P160 仅在第 16 位氨基酸出现 16Phe→Ser 的替换，其他氨基酸序列一致，未发生变异（图4）。 综上结果表明，苍蝇源与猪场猪源以及PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因之间存在多个氨基酸位点的替换和缺失， 且苍蝇源PRRSV 与猪场猪源以及其他PRRSV 代表株的ORF5 基因氨基酸变异位点多于NSP2基因，而猪场猪源的NSP2 和ORF5 基因和其他PRRSV 代表株之间未见明显差异。

图4 苍蝇源与猪场猪源以及其他PRRSV 代表株 ORF5 基因氨基酸差异位点分析Figure 4 Different site analysis of amino acid for PRRS VORF5 genes from flies, pigs and the representative strains

2.4 苍蝇源与猪场猪源以及其他PRRSV 代表株NSP2 和ORF5 基因遗传进化树分析

采用Fig tree、MHGA 生物信息软件分别对苍蝇源与猪场猪源以及其他代表株PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因进行遗传进化树分析。 结果表明，苍蝇源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因与高致病性PRRSV GD 株的亲缘关系较近，而猪场猪源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因与PRRSV NVDC 株的亲缘关系较近，说明苍蝇源PRRSV 与本猪场猪源PRRSV 可能来源于不同的毒株， 这是否与苍蝇在不同区域飞行机械传播的特性具有相关性需要进一步的研究，但无论是苍蝇还是猪场猪源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因均属于美洲基因型分支，与欧洲基因型代表株Huro PRRSV 和Lelystadvirus 不在一个分支（图5）。

图5 苍蝇源与猪源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因遗传进化树分析Figure 5 Phylogenetic tree analysis of PRRSV NSP2 and ORF5 genes from flies, pigs and other PRRSV representative strains

3 讨论与结论

PRRS 是能够引起母猪繁殖障碍及仔猪呼吸系统疾病的高度致死性传染病， 是严重威胁全世界养猪业发展的猪的主要疫病之一。我国自1996 年首次报道以来目前PRRS 已遍布全国。PRRSV 具有变异性和多样性，遗传变异的结果可以导致PRRSV 的某些生物学特性发生改变。 我国2006 年4 月发生的“猪高热病”也是由于PRRSV NSP2 基因缺失30 多个氨基酸变异成高致病性PRRSV， 更是造成了高达数千亿元人民币的经济损失[13-14]。 2010 年从白俄罗斯分离的“丽娜”为新型变异的PRRSV，属于第3 种基因亚型的PRRSV，可导致40%的仔猪死亡。 此外，新毒株的流行也极易造成PRRS 的大面积爆发[15]。 猪是PRRSV 的自然感染宿主，感染猪、公猪精液、污染的用具和车辆等均为传染源[16]，而国外学者在研究PRRSV 传播途径时在其他生物体内发现了PRRSV，进而证实了家蝇和刺扰伊蚊等媒介可传播或携带该病毒[17-18]。 本研究以此为切入点，分析苍蝇源与猪场猪源以及其他PRRSV 代表株的基因遗传变异特性， 从而探讨飞行虫媒在传播PRRSV 中的作用，为初步评估环境中生物媒介传播PRRSV 的潜在风险提供了理论依据，这对PRRSV 传播途径的研究及评价公共卫生具有重要意义。

检测结果表明，苍蝇源PRRSV NSP2 基因与猪场猪源及其他PRRSV 代表株的NSP2 基因核苷酸的同源性为45．9%～95．9%， 氨基酸同源性为 33%～92．9%。 而苍蝇源 PRRSV ORF5 基因与猪场猪源及其他 PRRSV 代表株的ORF5 基因核苷酸的同源性为 61．5%～95．2%，氨基酸同源性为 32．5%～90．9%。 进一步的序列分析结果显示苍蝇源PRRSV NSP2 和ORF5 基因的氨基酸位点存在多个位点的替换和缺失。 表明苍蝇源PRRSV NSP2 和ORF5 基因与猪场猪源及其他PRRSV 代表株相应的基因均存在不同程度的位点差异。 从进化树的关系来看苍蝇源与猪源猪场PRRSV 同属美洲群分支，但二者分别与PRRSV GD 株和NVDC 株同源关系最近，初步推测苍蝇源和猪场猪源PRRSV 可能来源于不同的PRRSV 毒株，这是否与苍蝇在不同区域飞行机械传播的特性具有相关性需要进一步的研究。 此外在本研究中，采集了8 家PRRSV 感染猪场环境中的苍蝇和病猪淋巴结样本，虽然并不是从所有感染猪场的苍蝇样本中检测到了PRRSV， 但对PRRSV 阳性的苍蝇样本同时开展了包括PRRSV NSP2 和ORF5 基因在内的多个基因的多次RT-PCR 检测。测序结果均表明，苍蝇源和猪场猪源PRRSV 的NSP2 和ORF5基因高变区变化程度相对PRRSV 的其他基因较明显（其他相关基因的数据会在后续研究中发表NSP2。 结合相关资料初步分析认为，PRRSV 的NSP2 和ORF5 为PRRSV 易变异基因，非保守基因，其变异频率本就高于其他基因[19-20]，而本研究是将收集的苍蝇样本反复冲洗后取其腹部采用RT-PCR 检测PRRSV 基因，所以苍蝇源的PRRSV 主要来源于苍蝇内部，虽然此前报道在苍蝇体内同样检测到PRRSV[11]，但毕竟苍蝇并不是PRRSV 易感的生物宿主，这种非宿主生物体内环境可能促进了NSP2 和ORF5 基因变化的频率[20-21]，而且PRRSV 在其非易感宿主内不能高效率复制， 导致病毒载量的降低， 本研究采用套式PCR 方法才检测到了苍蝇源PRRSV ORF5 基因，也正好验证了初步推测。然而，苍蝇源PRRSV 基因的这种变异是否会引起PRRSV 生物学特性的改变目前还不清楚， 重要的是PRRSV 基因在自然环境和苍蝇体内的变异特性与苍蝇等飞行媒介携带并传播病原特性的双重结合，是否会给公共卫生安全带来潜在危险，是值得进一步思考的问题。 因为没有从苍蝇体内分离PRRSV，并且本研究中的苍蝇主要是以腐生方式为主的舍蝇，因此，不能够确定苍蝇源PRRSV 是来自于苍蝇的体外携带还是吸入了PRRSV 污染的食物。 在后续研究中，会继续开展从苍蝇体内分离PRRSV，进一步了解苍蝇源PRRSV的生物学特性，为全面分析比较苍蝇源和猪源PRRSV 的差异特点提供理论依据。 综上，苍蝇源和猪场猪源以及PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因存在不同程度的差异，为飞行昆虫媒介传播病原的潜在风险提供初步评估指标，也为进一步研究其传播途径、分子流行病学及毒株之间的种系进化关系等提供重要的理论参考依据。