加味逍遥散对LPS诱导的抑郁模型大鼠海马小胶质细胞TLR4/NF-κB通路的影响*

郭 锐，秦卫帅，张双勇，张淑玲

(1.郑州市中医院脑病一科，河南 郑州 450007；2.郑州市人民医院神经内科，河南 郑州 450003)

抑郁症是严重威胁人类身心健康的重大疾病，目前全球约有9亿人口患有不同程度的抑郁症，且发病率逐年升高，预测到2020年，将成为世界第二大疾病[1]。越来越多的证据表明，脑内免疫失衡是导致抑郁症发生的关键原因[2-3]。小胶质细胞作为脑内的巨噬细胞，扮演着神经系统“清道夫”的角色，可通过固有和适应性免疫反应参与神经免疫调控[4]。那么，在抑郁症状态下，小胶质细胞是否呈现过度激活态，其涉及的相关分子机制如何，尚鲜有深入报道。加味逍遥散是在经方逍遥散基础上增加姜黄、香附、酸枣仁等药物，能增强原方的疏肝健脾、宁心安神功效，临床疗效明显[5]。本研究以海马小胶质细胞为靶区，从免疫调节相关的TLR4/NF-κB信号通路为切入点，探讨加味逍遥散对LPS诱导的免疫损伤抑郁模型大鼠的保护作用及其机制，以期为该方在临床上进一步推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠，60只，体质量为180～220 g，购自北京维通利华实验动物有限公司。实验期间大鼠均饲养在室温(24±2)℃、相对湿度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的标准环境中，自由摄食饮水。

1.2 药物

加味逍遥散由柴胡、白芍、当归、川芎、白术、茯苓、姜黄、香附、酸枣仁、郁金、甘草组成，药材均购自郑州市中医院。该方提取两次，第一次加入10倍量水浸泡30 min后武火煎煮至沸腾，转为文火慢煎 1.5 h～2 h，倒出煎液，加入8倍量水再煎煮一次，合并两次水煎液，浓缩至生药量为2 g/ml后保存备用。盐酸氟西汀分散片购于礼来苏州制药有限公司，批号为0934A。

1.3 试剂与主要仪器

LPS购自美国Sigma公司；ELISA试剂盒购自南京建成生物公司；RIPA裂解液购自美国Thermo公司；兔抗大鼠Iba-1单克隆抗体购自美国Sigma公司；兔抗大鼠TLR4、NF-κB多克隆抗体购自英国Abcam公司；山羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；超微量核酸蛋白测定仪购自英国BioDrop公司；凝胶成像分析仪购自美国Bio-Rad公司；组织切片机购自美国Thermo公司，显微镜购自德国Zeiss公司。

1.4 动物分组、造模与给药

大鼠适应性喂养3 d后，进行旷场实验，剔除掉自主活动次数明显偏离平均值的大鼠，并依照该指标将动物随机分为5组，包括对照组、模型组、氟西汀组、加味逍遥散低、高剂量组，每组11只。除对照组外，其余组均参照文献方法[6]，采用慢性LPS注射诱导抑郁大鼠模型，每天腹腔注射LPS 0.5 mg·kg-1，共14 d，对照组注射等量生理盐水。于造模同时灌胃给药，氟西汀组给药剂量为10.8 mg·kg-1，加味逍遥散低、高剂量组分别给予临床等效1、2倍剂量(3.64、7.28 g·kg-1)，正常组与模型组均给予等量蒸馏水，灌胃体积为10 ml·kg-1。末次给药结束后1 h，对所有大鼠进行行为学测试，完成后立即取材。

1.5 行为学测试

1.5.1 旷场测试 将大鼠放入底部及四周均为黑色的敞箱中，底部均匀划分为25个小格。大鼠于敞箱中自由活动1 min后，记录其接下来4 min内的水平活动次数(四爪均落在小格内)和垂直站立次数(两前爪抬离底部)。

1.5.2 强迫游泳实验 将大鼠放入高50 cm、直径20 cm、水深35 cm的透明圆柱形筒中，待大鼠适应1 min后，记录接下来4 min内的不动时间(以两前爪停止游动，身体漂浮为不动)。

1.6 免疫组化法检测小胶质细胞标志蛋白Iba-1的表达

取固定于4%多聚甲醛溶液中的脑组织，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后，以5 μm厚连续切片；分别用75%、95%、100%梯度乙醇脱水，浸蜡，水化，冲洗，滴加山羊血清封闭液，37℃孵育30 min，加Iba-1一抗孵育过夜；PBS洗3次，反应增强液孵10 min，二抗孵10 min；冲洗，DAB染色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，封片。将切片置于显微镜下进行拍摄，并采用Image-Pro Plus软件分析积分光密度值(integrated optical density, IOD)。

1.7 ELISA试剂盒检测海马匀浆液TNF-α、IL-6的含量

取冷冻保存的海马组织，称重，加入3倍量的生理盐水，冰上匀浆，4℃、12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，ELISA法检测TNF-α、IL-6的含量，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.8 Western blot法检测TLR4、NF-κB蛋白的表达

取冷冻保存的海马组织，加入一定量RIPA裂解液，冰上匀浆，在4℃、12 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液制备组织蛋白提取液，BCA试剂盒法测定总蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶，蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳至溴酚蓝跑出分离胶后，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，根据目的蛋白分子量裁剪条带，分别加入稀释后的一抗，4℃孵育过夜。次日用TBST液洗涤条带4次，每次10 min，加入二抗室温下孵育4 h，TBST液洗4次，每次10 min，之后进行ECL显影。应用Image J软件分析条带灰度值，根据目的蛋白和内参蛋白对应灰度值的比值计算蛋白相对表达水平。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 加味逍遥散对大鼠行为学的影响

与对照组比较，模型组大鼠水平及垂直运动能力均显著下降(P<0.01，表1)，强迫游泳不动时间显著增加(P<0.01)，抑郁样行为显著；与模型组比较，施加氟西汀及高剂量加味逍遥散干预后均能提高抑郁大鼠的自主活动能力(P<0.01或P<0.05)，降低大鼠的不动时间(P<0.01)，改善抑郁样行为；与氟西汀组比较，加味逍遥散低剂量组不动时间显著增加(P<0.01)，但高剂量组各行为学均与氟西汀无明显差异(P>0.05)。

Tab. 1 Effects of modified Xiaoyao San on behavior of rats n=10)

2.2 加味逍遥散对大鼠海马小胶质细胞标志蛋白Iba-1表达量的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马Iba-1表达显著增加(P<0.01，图1，表2)，小胶质细胞呈激活态；与模型组比较，施加氟西汀或高剂量加味逍遥散干预后，Iba-1表达水平明显降低(P<0.01)且基本恢复正常水平，小胶质细胞逐渐恢复成静息态；与氟西汀组比较，加味逍遥散高、低剂量组Iba-1表达均无统计学差异(P>0.05)。

Fig. 1 Immunohistochemical detection of hippocampal Iba-1 expression in rats(×200)

Tab. 2 Effect of modified Xiaoyao San on the expression of Iba-1 in hippocampus of rats n=5)

2.3 加味逍遥散对大鼠海马匀浆液中TNF-α、IL-6含量的影响

LPS注射建立抑郁模型成功后，与对照组比较，模型组大鼠海马炎症因子TNF-α、IL-6含量显著升高(P<0.01，表3)；与模型组比较，施加氟西汀或高剂量加味逍遥散组后，海马中TNF-α、IL-6含量显著下降(P<0.01)，同时，低剂量的加味逍遥散也能降低海马TNF-α的水平(P<0.05)；与氟西汀组比较，高剂量加味逍遥散组TNF-α、IL-6含量无明显差异(P>0.05)，低剂量加味逍遥散组IL-6含量升高(P<0.05)。

Tab. 3 Effects of modified Xiaoyao San on TNF-α and IL-6 in hippocampal homogenate of rats(pg/ml, n=5)

2.4 加味逍遥散对大鼠海马TLR4、NF-κB蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马TLR4、NF-κB表达均显著升高(P<0.01，图2，表4)；施加氟西汀或高剂量加味逍遥散干预后，TLR4、NF-κB蛋白表达水平均得到明显逆转(P<0.01或P<0.05)，同时低剂量加味逍遥散也能下调TLR4表达；与氟西汀组比较，高、低剂量的加味逍遥散对TLR4、NF-κB表达的影响均无统计学差异(P>0.05)。

Fig. 2 The protein expressions of hippocampal TLR4 and NF-κB in rats detected by Western blot

Tab. 4 Effects of modified Xiaoyao San on TLR4 and NF-κB expressions in hippocampus of rats n=4)

3 讨论

抑郁症动物模型主要包括物理应激和药物诱导两大类。近年来，免疫紊乱在抑郁症发生过程中的作用日益受到重视，采用LPS腹腔注射的方法能建立抑郁症神经免疫损伤模型。本研究中，模型大鼠自主活动能力下降，强迫游泳不动时间增加，抑郁样行为显著；而在给予阳性药氟西汀及中药复方加味逍遥散后，动物的抑郁样行为明显缓解。

海马是负责机体学习、记忆的关键脑区，与抑郁症的发生发展密切相关。海马主要由神经元和胶质细胞组成，其中，小胶质细胞被认为是中枢神经系统免疫监督的关键细胞，具有巨噬细胞的特征，约占胶质细胞总数的20%[7]。小胶质细胞具有静息和活化两种状态，在健康状态下，MG呈静息状态；当受到病理因素的刺激时，其被激活，由分枝状变为阿米巴状，并释放大量的氧自由基、促炎性因子等神经毒性物质，引起中枢神经系统的炎症反应[8-9]。过度的炎症反应会刺激并损伤神经元，进而导致抑郁症、阿尔兹海默症、帕金森症等中枢神经系统疾病的发生[10]。因此，如何抑制小胶质细胞的过度活化，从而减轻炎症反应所引起的损伤显得尤为重要。本研究发现，抑郁模型大鼠小胶质细胞标志蛋白Iba-1表达显著增加，炎症因子TNF-α、IL-6含量显著上升，而加味逍遥散能抑制小胶质细胞的过度激活，减轻脑内的炎症反应。

TLR4/NF-κB信号通路是调节TNF-α和IL-6等炎症因子表达的重要途径[11-12]。TLR4属于I型跨膜受体蛋白，是一种模式识别受体，识别包括LPS在内的多种配体。当TLR4与相应配体结合后，能进一步激活NF-κB通路，从而促进各种炎性细胞因子基因表达的激活、炎性因子产生和释放[13]。在脑内，TLR-4和NF-κB主要在小胶质细胞中表达，小胶质细胞的活性受到TLR4/NF-κB通路的调控，以往研究发现，抑制TLR4的表达能够降低小胶质细胞的活化，并减少神经元凋亡[14]。因而，本研究认为TLR4/NF-κB通路参与LPS抑郁大鼠小胶质细胞激活的过程。实验结果表明，模型组大鼠海马TLR4、NF-κB表达均明显升高，施加加味逍遥散治疗后能逆转该表达，说明该药物是通过调控该通路而抑制小胶质细胞的激活，并降低炎症因子的表达水平，进而保护海马组织。

抑郁症属于中医郁证范畴，多由于肝气郁结、脾失健运而致脑失神明，表现为胸胁胀满、纳呆、疲乏、燥渴等，病机属本虚标实，肝脾亏虚为本，气机阻滞、心神不宁为标，治宜健脾疏肝、宁心安神[15]。加味逍遥散是以《太平惠民和剂局方》中疏肝健脾经典方剂逍遥散为基础，根据临床实践，增加姜黄、香附、酸枣仁、郁金等药物，组成加味逍遥散，以增强其疏肝解郁、宁心安神功效，临床效果显著[16]。综上，加味逍遥散能明显改善LPS诱导抑郁模型大鼠的抑郁样行为，其作用机制可能与抑制海马小胶质细胞TLR4/NF-κB通路，进而下调炎症因子的表达有关。本文结果为临床治疗抑郁症提供实验依据。