无损检测技术在真菌鉴定及毒素检测中的应用
2020-11-27武琳霞翟文磊韦迪哲付海龙
武琳霞,翟文磊,韦迪哲,付海龙,王 蒙
(北京市农业质量标准与检测技术研究中心,农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(北京),北京 100097)
农产品在收获前和储运过程中极易受真菌污染,导致作物减产和品质下降,且在适宜的条件下会产生真菌毒素,严重影响农产品质量安全[1]。农产品中常见的真菌毒素包括曲霉菌(Aspergillus spp.)产生的黄曲霉毒素(aflatoxins,AFT)、青霉菌(Penicillium spp.)和曲霉菌产生的赭曲霉毒素(ochratoxins,OT)以及镰刀菌(Fusarium spp.)产生的伏马毒素(fumonisins,FB)、脱氧雪腐镰刀菌醇(deoxynivalenol,DON)、单端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)[2]。由于真菌毒素性质稳定,不易加工降解或去除[3],因此,尽早发现真菌侵染,并采取有效的防控技术是延长储存期、保证产品质量和食品安全的重要措施。
目前,农产品中产毒真菌的常规鉴定方法主要依赖于特定的微生物和生化鉴定,主要有平板计数法、选择性和鉴别培养基法、荧光分析法、微生物活性测定法、分子生物学方法等[3-4]。此外,基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱是近年来兴起的微生物快速鉴定分析技术[5]。真菌毒素通常含量较低,需要高效的提取富集和高灵敏的检测技术。常用的方法是薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、液相色谱串联质谱法[2]。其他方法包括酶联免疫吸附测定实验、免疫亲和检测[6]、免疫荧光检测[7]、适配体检测[8]或者生物传感器检测等[2,6]。尽管这些方法准确度较高,但是费时费力、成本高、效率低,难以满足现场快速检测的需求[3]。而且这些方法会破坏样品,在剔除不合格样品的过程中会损失掉一定量的样品。因此,建立一种快速、无损、低成本的检测产毒真菌和真菌毒素污染的分析方法对促进产业发展和保证消费安全具有重要意义。
目前,无损检测技术在包括谷物、粮油、饲料、蔬菜水果、肉类、茶叶等农产品中应用广泛,但多用于检测淀粉、氨基酸、蛋白质、脂肪、水分、纤维素、维生素、可溶性固形物、叶绿素、多酚等样品中含量较高的物质。由于真菌或真菌毒素的污染量通常很小,还受到品种、地域等条件的影响,因此实现精确测定通常比较复杂。然而基于真菌或毒素对样品中高含量成分的影响,通过无损检测技术对其进行间接检测在国内外已有报道,包括光谱学技术(如近红外光谱、中红外光谱、拉曼光谱、荧光光谱、太赫兹时域光谱)、成像技术(如高光谱及多光谱成像、彩色成像、热成像、X射线成像)以及电子鼻技术等。本文综述了无损检测技术在检测农产品中产毒真菌及真菌毒素中的应用和进展,并介绍了其面临的挑战和未来的发展趋势。
1 光谱学技术
1.1 近红外光谱法
红外光谱法是测定农产品或食品中真菌及毒素污染的方法之一。其中,近红外光谱(near infrared spectroscopy,NIR)是指介于可见光和中红外光之间的电磁波,波长范围700~2 500 nm,一般有机物在该区域的近红外光谱吸收主要是含氢基团(—OH、—NH2、—SH)等的倍频和合频吸收[7]。因为基于红外光谱的方法灵敏度有限,目前无法在复杂的基质(如食品)中直接测定包括真菌毒素在内的污染物,而是通过由农产品内在特征的变化而引起的红外光谱中指纹区域的改变来进行间接检测[8]。
红外光谱法在测定小麦[8-9]、大麦[8]、玉米[10-11]等中的真菌及毒素具有广泛应用(表1),分类及回归模型预测精度均较高,但Dachoupakan Sirisomboon等[12]研究表明淀粉和水分含量对NIR测定可能产生较大影响。与传统NIR相比,傅里叶变换近红外光谱(Fourier transform near infrared spectroscopy,FT-NIR)通过干涉仪进一步提高了光谱精度、再现性和波长分辨率[13]。因此在玉米粉[14]、小麦[15-16]、稻谷[17]、糙米[18]、大米[19]、花生[20]等样品中得到了广泛的应用。但这些方法多基于全波长扫描及多波长建模,为了建立高效的分类模型,Stasiewicz等[11]利用多光谱方法在9 个不同波长处对AFT含量大于10 μg/kg和FB含量大于1 000 μg/kg的玉米粒进行鉴别分析,结果可达到77%的灵敏度和83%的特异性。Falade等[10]表明在单波长(2 198 nm)下,多元线性回归模型可以区分不同成熟度玉米粒是否受黄曲霉侵染,模型决定系数(R2)可达0.88。NIR作为检测农产品理化性质应用最广泛的光谱技术之一,由于其检测效率高、成本低而成为一种有使用前景的产毒真菌和毒素污染的无损检测方法。然而尽管许多研究将近红外技术应用于真菌及毒素的检测,但并没有明确地指出方法的检测限[21]。由于FT-NIR具有较高的仪器稳定性、光穿透深度和模型预测能力,被广泛应用于农产品的无损检测,但是仪器仅适用于静态检测分析,而不适用于工厂机械分选机中使用,因为机械振动和温度变化会对其产生影响[13]。
1.2 中红外光谱法
中红外光谱(mid infrared spectroscopy,MIR)的波长范围约为2 500~25 000 nm,依赖于基质的分子振动。电磁波谱的NIR和MIR波段都包含对生物大分子(蛋白质、脂类、碳水化合物等)中官能团(例如羰基、酰胺基、酯基、醇羟基、亚甲基等)的选择性信息。其主要区别在于MIR中的吸收对应于分子振动的基频,而NIR中的吸收对应于振动的泛音和组合带[18]。由于MIR测量的是基本振动,因此可以获得比NIR更加丰富的信息。
傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)主要是应用电磁光谱的MIR区(2 500~25 000 cm-1),通过监测分子的基本振动和旋转伸展,得到样品的化学谱图。del Girolamo等[16]通过FT-MIR对污染OTA的硬质小麦样品进行了筛选。以2 μg/kg为阈值,PLS-DA和PC-LDA分类模型总的分类率都高于94%。Singh等[22]利用FT-IR同步辐射红外成像技术研究储藏小麦受灰绿曲霉(A. glaucus)侵染后的成分变化,利用主成分得分的k-均值聚类可以清楚地区分正常样品和污染样品。Shen Fei等[18]利用FT-IR对于不同AFB1污染水平的糙米样品进行分类,LDA的正确分类率为96.9%。利用PLSR分别测定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2含量和总量时,也具有良好的预测精度(验证集相关系数r为0.922~0.970,RPD为2.5~4.0)。基于FT-IR无损分析技术,沈飞等[19]发现主成分分析(principal component analysis,PCA)-LDA对大米受不同霉菌感染及霉变状态的识别率分别达到86.0%和87.5%。Kos等[23]利用FT-IR对被DON污染的玉米(以1 750 μg/kg为阈值)和被AFB1污染花生(以8 μg/kg为阈值)进行分类,自助聚集(袋装)决策树方法分类准确率分别为79%和77%。
表1 近红外光谱技术在产毒真菌鉴定及毒素检测中的应用Table 1 Overview of the application of near infrared spectroscopy for identification of mycotoxin-producing fungi and mycotoxin detection
衰减全反射-傅里叶红外光谱(attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)是一种分子振动光谱技术,它无需对样品进行复杂的预处理,能够快速获得样品的光谱指纹特征。沈飞等[24]利用ATR-FTIR对小麦、面粉及面粉制品样品中的DON含量建立了PLSR和逐步多元线性回归(stepwise multiple linear regression,SMLR)的定量分析模型,结果显示两种方法均能较好预测样品中的DON含量,预测集R2达0.86。沈飞等[25]还应用ATR-FTIR将糙米按AFB1含量高低进行分类,k近邻算法(k-nearest neighbors,KNN)判别分析模型的预测整体正确率达到83.3%。运用PLSR分析建立的定量模型预测相关系数、RMSEP和相对分析误差分别为0.970、70.8 μg/kg和4.0。Kaya-Celiker等[26]利用ATR-FTIR对常见的花生中曲霉属真菌菌落数进行了PLSR回归分析,所得结果R2较高,为96.20%~99.98%,RMSE较低(0.014~0.153(lg(CFU/g)))。
近年来,量子级联激光器(quantum cascade lasers,QCLs)被认为是最先进的光源,由于其体积小、输出功率高、操作稳定性强和广泛的可调谐性(每个设备大于400 cm-1),有助于在便携式MIR光谱和传感器的中使用。Sieger等[27]利用中红外可调谐QCL光谱对被DON污染的玉米和小麦样品及被AFB1污染的花生样品的分类,结果表明DON、AFB1含量分别以1 250 μg/kg和8 μg/kg为阈值时,利用PCA可进行有效分离。
尽管MIR技术在定量分析研究中受到了许多研究者的青睐,但其准确度仍然是一个需要解决的问题[28-29]。可见-红外光谱技术只关注样品的一小部分,无法提供整个空间分布内的样品信息,因此难以应用于颗粒较小样品的无损检测[30]。而且它适用于检测污染物均匀分布的样品,由于真菌及毒素在农产品中的污染极其不均匀,这可能会影响方法的精度,因此需要对样品进行多点检测,以更好地预测样品的总体污染水平。
1.3 荧光光谱法
当荧光基团(荧光结构或荧光分子)吸收紫外线、可见光和红外光后发射的光称为荧光。当荧光光基团吸收特定波长的能量时,分子就会释放出更高波长的能量[31]。荧光光谱作为一种无损、高灵敏度、特异性强和经济高效的分析技术,已广泛应用于农产品中真菌毒素的检测[13]。由于荧光光谱法只有在没有或很低背景荧光成分存在的情况下才能进行鉴定[32],然而多种农产品含有多种荧光成分,因此该方法对真菌毒素的测定较困难。为了能够检测样品中真菌毒素的微弱荧光,激光诱导荧光光谱(laser induced fluorescence spectroscopy,LIFS)技术得到了发展应用。这是由于LIFS在特定波长和较窄的带宽强光作用下,可以显著增强荧光信号[33]。
Paghaleh等[33]研究表明紫外光源(308 nm)-LIFS可用于开心果中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的含量测定,结果与高效液相色谱法一致。Wu Qingfang等[34]利用多光纤LIFS鉴别未污染AFB1和低污染水平(<50 μg/kg)的开心果,结果表明SVM和二阶导数光谱相结合的三光源模式可得到高于97.0%的分类正确率。基于174~1 100 nm的SMLR模型对三光源LIFS具有最高的预测精度(RMSEP<4.5 μg/kg)。Smeesters等[32]研究发现利用单光子诱导荧光和双光子诱导荧光可以鉴定受AFT污染的玉米样品。Cheng Xianbin等[35]在紫外-近红外光谱(304~1 086 nm)范围内,利用反射和紫外激发荧光,扫描运动中的单粒玉米,利用RF分类模型对AFT总量是否超标(20 μg/kg)的样品进行分类,训练集和测试集的分类准确率均为97%以上。
由于检测样品的背景荧光成分常常会影响所获得的荧光光谱,从而导致荧光峰混合或位移。因此,采用合适的化学计量学方法处理荧光光谱数据显得更为重要。
1.4 拉曼光谱技术
拉曼光谱技术是基于化学键的极化率,较其他技术对分子非极性基团中共价键的对称振动更为敏感,其操作简单、无损、快速、便携、重复性、灵敏度高、不受水分子等干扰、很少有重叠带,可以为定性和定量检测真菌及其毒素的化学官能团及其衍生物提供更多有价值的信息[7]。虽然红外光谱和拉曼光谱都是振动光谱,但与红外吸收不同,拉曼光谱是基于光子与分子的能量交换。当分子从基态跃迁至激发态,然后回到激发振动态时,就会产生拉曼散射。增强拉曼效应的技术包括受激拉曼散射、相干反-Stokes拉曼散射、共振拉曼光谱和表面增强拉曼光谱(surface enhanced raman spectroscopy,SERS)。其中SERS技术应用较为广泛,它结合了拉曼光谱和纳米技术,通过使用金属纳米材料来提高传统拉曼光谱的灵敏度和容量[36]。
Lee等[28]运用拉曼光谱预测玉米中的AFT含量,PLSR和多元线性回归模型的预测R2均在0.94以上。Yuan Jing等[37]建立了基于SERS快速检测谷物中DON的方法,并将建立的方法应用于玉米、芸豆和燕麦中DON的检测,结果表明利用便携式拉曼系统和银纳米粒子在短时间内能成功地检测到玉米中浓度为100 nmol/L的DON。同时芸豆和燕麦中DON的检测限分别为10-6mol/L和10-4mol/L。Mignani等[38]利用拉曼光谱,以DON含量是否高于400 μg/kg对小麦麸皮样品进行分类,结果表明KNN分类准确率为82%。拉曼光谱可以以其无损、快捷、无污染、低干扰、快速准确的特点应用到实际生活的各类检测中,利用其进行真菌及毒素无损检测是一个新兴的思路和探究方向,具有一定的研究价值和前景。但拉曼光谱受信号强度的限制,因为与近红外和中红外吸收光谱相比,拉曼散射受样品荧光的影响很大,因此需要对拉曼光谱荧光干扰进行校正,需要高稳定性的激光光源和灵敏的放大设备来检测易受生物荧光干扰的微弱信号,这也使得拉曼仪器的成本更高[30];因此今后的工作重点应放在开发低成本的激光光源和放大仪器上。应用拉曼光谱的另一个限制是当其用于固体或非均质样品分析时,许多因素,如颜色、吸光度和粒度,都会影响固体样品的拉曼光谱测定。而且拉曼光谱主要应用于体积较小的样品且灵敏度较低,限制了该技术的工业应用[8]。
1.5 太赫兹时域光谱技术
太赫兹技术波介于毫米波和红外光之间,属于远红外波段,是一个非常具有科学研究价值的电磁波辐射区域。研究表明,分子之间弱的相互作用如氢键、范德华力、偶极的旋转和振动跃迁以及晶格的低频振动吸收只有在太赫兹波段才能有所响应[39]。太赫兹时域光谱(terahertz time-domain spectroscopy,THz-TDS)技术是基于飞秒超快激光技术远红外波段光谱测量的新技术,可以有效反映有机生物分子的结构和性质,作为物质“指纹”谱,该技术逐渐应用于有机生物分子的定性、定量分析,在近红外光谱、拉曼光谱、X射线等众多光谱类快速无损检测技术中成为一种极具竞争力的新兴检测技术[40]。
廉飞宇等[41]根据AFB1溶液在不同频率范围内光学参数(主要是折射率和吸收系数)的不同,利用太赫兹光谱对其进行定性分析,并利用最小二乘支持向量机对其进行定量分析。结果表明,利用THz-TDS能够对溶液中AFB1浓度进行精确识别。Ge Hongyi等[42]利用太赫兹光谱法测定质量浓度范围为1~50 μg/mL和1~50 μg/L AFB1乙腈溶液的太赫兹光谱,并对其在0.4~1.6 THz的频率范围进行了分析。利用不同的方法建立样品吸收光谱与质量浓度之间的非线性回归模型,结果表明,PLS和主成分回归模型在1~50 μg/mL质量浓度范围内拟合较好,而SVM和PCA-SVM在1~50 μg/L范围内拟合较好。此外,还对10 个从霉变玉米中提取的未知AFB1质量浓度样品进行了定量分析,其最小误差范围为0.76~2.39 μg/L。虽然THz-TDS是一个在化合物定性与定量分析中很有应用价值的技术,但目前在农产品真菌及毒素检测领域应用较少,且目前多以真菌毒素溶液为研究对象,较少研究能够真正实现无损检测。
2 成像技术
2.1 高光谱及多光谱成像技术
在农产品质量安全领域,高光谱成像(hyperspectral imaging,HSI)是一种能够表征复杂基质特性的新兴技术,得到了广泛地应用。HSI也称为化学或光谱成像,它能够将传统成像和光谱学结合起来,获得研究对象的空间和光谱信息。HSI是由数百个连续的波段组成,这些波段对应于不同空间位置样本对应的光谱。HSI可在紫外、可见光和近红外区域(300~2 600 nm)范围内获得样品的空间和光谱信息[43]。针对不同类型样品,开发了针对多电磁波谱的HSI技术如紫外(200~400 nm)、可见光(380~800 nm)、可见光/近红外(400~1 000 nm)、近红外(900~1 700 nm)和短波红外(970~2 500 nm),其中后3 种技术常用于农产品[36]。近几年的研究表明,利用高光谱技术实现农产品中的产毒真菌或真菌毒素的快速、无损检测具有很大的发展潜力。
在检测方法上,高光谱反射、高光谱荧光、高光谱可见近红外光谱(visible-near infrared spectroscopy,VNIR)和高光谱短波近红外光谱(shortwave infrared spectroscopy,SWIR)都是检测农产品中真菌及毒素的常用且有效的方法。但样品的水分、蛋白质、淀粉和脂肪等组分可能会影响HSI对真菌毒素的预测精度,特别是利用SWIR-HIS检测时[44]。尽管样品水分含量对VNIR-HIS的光谱信号无显著影响[45],但由于短波近红外成像系统(电荷耦合器件(charge coupled device,CCD)相机)的成本远低于长波近红外成像系统(如铟镓砷(InGaAs)相机),近几年来越来越多的研究开始利用SWIR-HSI对真菌及毒素进行检测[46]。荧光HSI技术是为了获得高光谱和高空间分辨率的荧光图像数据而发展起来的,其图像具有与VNIR-HSI图像相似的高光谱和空间分辨率[47],现已广泛应用于玉米[47-51]、花生[52]、开心果[53]等产品中AFT和产毒真菌的检测。然而,由于发射响应的限制,即使在成像中使用较长的数据采集时间,荧光图像的强度通常也远低于VNIR-HSI图像的强度[47]。
HSI需要在较宽的光谱区域内,在狭窄和相邻的波长或波段上获得成千上万个光谱图像,而多光谱成像技术(multispectral imaging,MSI)是通过成像光谱仪或滤光片在不同宽度和间距的离散波段进行采样,仅具有少数几个重要的波段信息[13]。作为HSI的一种简化形式,MSI被越来越多地应用于各种农产品中产毒真菌和真菌毒素的检测。Kalkan等[54]利用MSI判别榛子和辣椒粉是否受AFT污染,结果表明二维局部判别基(local discriminant bases,LDB)算法对榛子(以4 μg/kg为阈值)和红辣椒(以10 μg/kg为阈值)的分类准确率分别为92.3%和79.17%。再将该算法对是否受真菌污染的榛子仁进行分类,分类准确率达95.67%。Kalkan等[55]使用荧光MSI来区分正常无花果和AFT污染无花果,结果的错误率较低,分别为9.38%和11.98%。HSI的主要缺点是体积大、设备成本高、计算量大,需要复杂的处理算法,降低了计算速度。因此,有必要通过定性和定量分析来寻找最佳波段。通过对选定波段的确定,可以开发出一种通用孔径多光谱系统,在降低成本和缩短分析时间的同时,提高计算速度,以满足在线或实时应用的需要。此外,真菌和毒素污染并不是在一个批次内所有样品和位置均匀发生,因此,相对低速的HSI和MSI在有效评估整个样本方面仍然存在许多挑战,HSI系统的硬件速度有待进一步提高,以实现对大量高光谱数据的快速采集和分析。
在硬件设施改进的基础上,高光谱技术的建模算法也在不断地改进。HSI提供了有关样本的详细信息,然而使用相关而冗余的波长可能会降低分类的准确性。因此在合理范围内减少特征向量的维数不仅可以提高分类器的性能,而且可以提高计算速度,从而更好地解决问题[56]。最常用的特征向量选择方法是PCA,随着计算机技术的发展,更多简洁且高性能的特征向量选择算法得到应用,例如对比连续投影算法(successive projections algorithm,SPA)[57-59]、非参数加权特征提取(nonparametric weighted feature extraction,NWFE)[60]、基于MLP连接权值显著性度量[56]、SFFS[61]、改进格拉姆斯密特算法(modified Gram-Schmidt,MGS)与遗传无信息变量消除算法(genetic uninformative variable elimination,GAUVE)[62]等方法能有效地提取特征波长,进而建立最高效、准确的模型。表2总结了目前HSI技术在农产品中产毒真菌鉴定或毒素检测的建模方法,其中常用PLS-DA[63]、因子判别分析(factorial discriminant analysis,FDA)[64-65]、LDA、二次判别分析(quadratic discriminant analysis,QDA)、马氏统计判别模型[46,66-67]、SVM[62]、光谱角制图(spectral angle mapper,SAM)[68-69]都具有较高的有效性和准确性,但这些研究主要以单粒样品为研究对象,多集中在光谱信息的分类和识别,而空间信息被忽略。Qi Xiaotong[59]和Jiang Jinbao[70]等则分别利用联合稀疏表示模型(joint sparse representation based classification,JSRC)和带标记控制的分水岭算法能够利用空间信息从而识别图像中受污染像素(部分颗粒)的分布。此外,常用的PLSR、多元线性回归(multiple linear regression,MLR)、主成分回归(principal component regression,PCR )、SVM、KNN等均是有监督的学习算法,即对数据集的正确输出已知情况下的一类学习算法。而Siripatrawan等[71]首次利用无监督学习的化学计量学方法——自组织映射网络(self-organizing map,SOM)对糙米粒受真菌感染的不同程度进行分类,并通过图形可视化,为无损检测提供了一个新的思路。未来的研究应该更多地结合空间信息,在单粒样品的基础上确定严重污染的部位,以防将部分严重污染样品直接认定为正常样品。且非监督学习的方法不需要预先对所要分类的区域进行深入了解,从而降低人为误差的概率,因此将会是未来研究的发展趋势。
表2 高光谱和多光谱成像技术在产毒真菌鉴定及毒素检测中的应用Table 2 Overview of the application of hyperspectral imaging and multispectral imaging techniques for identification of mycotoxin-producing fungi and mycotoxin detection
续表2
2.2 彩色成像技术
与正常农产品相比,受真菌侵染的农产品特性发生改变,例如品质降低与物理特性的变化,包括颜色变浅、质量降低等。应用彩色成像技术可以精确地捕捉到这些变化[84]。彩色成像技术提取到的彩色图像特征包括红绿蓝颜色直方图、强度、色调范围、饱和度和由灰度共生矩阵得出的纹理特征,利用适当的图像处理算法进行产毒真菌或毒素污染的预测。彩色成像的优点是可以分析整个样品表面以及量化表面特性[85]。
彩色成像技术已应用于检测小麦[46,84]和玉米中的真菌侵染[86]。Tallada等[86]利用彩色成像技术鉴别了8 种真菌在不同侵染水平下对玉米粒的污染情况,实验组和对照组的正确识别率均为75%。但该技术对不同真菌种类的分离效果并不理想。这可能是由于彩色成像获得光学数据的电磁波范围有限,而样品的物理变色是造成光学数据差异的唯一来源,因此,在侵染一段时间之后进行彩色成像应该更有效。Singh等[46]从感染真菌和正常小麦籽粒的彩色图像中提取了179 个特征(颜色和纹理)。之后利用逐步判别分析选定10 个特征参数,运用LDA、QDA和马氏判别分类法,对样品的正确分类率分别为94.3%、90.3%和89.3%。Jirsa等[84]利用LDA鉴别小麦是否侵染镰刀菌,结果表明基于颜色参数(红、绿、蓝)结合色调可以获得较好的判别效果,模型分类准确率为85%。与HSI系统相比,彩色数码相机成本较低,但对早期真菌鉴别效果不是很理想。
2.3 热成像技术
热成像是基于所有材料都发射红外辐射的特点,其可根据辐射量产生物体表面热分布的图像[87-88]。通过在一个区域上测量多个点的温度,并将其处理成物体表面的热图或谱图,再经过图像处理技术分析热图[89],从而提取统计特征和纹理特征以进行样品分类。
Chelladurai等[90]采用非致冷红外焦平面阵列热像仪对是否受A. glaucus、A. niger和Penicilliumspp.侵染的小麦样品进行热成像分析,LDA和QDA分类模型对未污染样品的分类准确率可达100%,对污染样品的分类准确率可达97%和96%。而该方法无法区分不同真菌种类,这是由于受不同真菌侵染的小麦在化学成分上的变化相似。热成像技术的局限性包括加热和冷却过程可能会改变热敏性产品的性质,热分布的变化有可能会影响热图。
2.4 X射线成像技术
X射线是波长约为0.01~10 nm的电磁辐射,它可以穿过物质,产生的图像可以直接反映内部缺陷以及内部密度和结构的变化[87]。X射线成像和计算机断层扫描是基于X射线衰减的差异,这种差异则主要是由被检测样品的密度差异引起的。由于真菌侵染可以引起农产品密度变化,这种变化可以通过从正常和受侵染样品的X射线图像中通过特征比较与提取来进行检测[91]。
Orina等[92]利用高分辨率X射线显微计算机断层扫描(50 kV、250 μA)研究了玉米粒受黄萎病镰刀菌(F.verticillioides)侵染后颗粒内部结构的变化。感染玉米粒和正常玉米粒内部结构的变化可以在二维和三维图像中显示出来,并根据籽粒总体积、空隙空间总体积和平均灰度进行量化。随着时间的推移,玉米粒总体积和平均灰度减小,空隙总体积增大。与其他成像技术相比,X射线成像具有明显的优势,例如它允许对样品内部特征进行无损成像,以检测隐藏的缺陷或污染。X射线微计算机断层成像的局限性在于它成本高,需要长时间的图像分析过程[93]。
3 电子鼻技术
产毒真菌在生长和代谢过程中会伴随着一些挥发性物质的产生,如醇类、醛类、酮类和酯类。电子鼻由一系列非特异性化学传感器组成,这些传感器可与不同的挥发性化合物相互作用,并生成信号,可作为被分析样品中挥发性物质的指纹信息,再通过模式识别系统识别或定量挥发性物质[94]。因此电子鼻也被广泛应用于产毒真菌鉴定及毒素含量的测定。
电子鼻技术已经成功地应用在小麦、玉米、大米及花生等真菌和毒素的分类鉴别与定量预测。Campagnoli等[94]采用PCA和分类回归树算法将被DON污染的硬质小麦样品分为3 类:未污染样品、污染含量低于限值(1 750 μg/kg)的样品、污染含量高于限值的样品,预测错误率分别为0%(20 个样本集)和3.28%(122 个样本集)。当将小麦粉按DON污染程度(DON含量<1 000 μg/kg、1 000 μg/kg≤DON含量≤2 500 μg/kg和DON含量>2 500 μg/kg)进行分类时,判别函数分析类准确率可达为82.1%[95]。在玉米样品的检测中,于慧春等[96]通过比较PCR、PLSR、BP神经网络、最小二乘支持向量机对ZEN与AFB1含量的预测模型。结果表明BP神经网络和最小二乘支持向量机法较好且具有较高的稳健性。之后,其利用电子鼻融合BP神经网络预测不同霉变程度玉米样品中的ZEN和AFB1含量,结果表明预测准确率较高[97]。沈飞等[98]研究表明PLS-DA法可较好区分不同AFT含量的糙米,模型的留一交互验证正确率高于80%。电子鼻技术对大米样品中的真菌及毒素也具有很好的检测结果,PLSR分析显示电子鼻响应信号与糙米中AFB1的预测精度最高,相关系数r和RMSEP分别达到0.808和127.3 μg/kg。宋伟等[99]通过PCA很好地区分了不同储藏条件的粳稻样品,PLSR结果表明电子鼻信号对霉菌数量可以进行定量预测,但存在准确度不够稳定的问题。沈飞等研究表明电子鼻技术结合PCA和LDA可以成功区分大米[18]和花生[100]受霉菌侵染的不同程度,识别率可达到90.0%以上。PLSR模型对花生菌落总数预测的R2和RMSEP分别达到0.814 5和0.244 0 CFU/g。但是常用的金属氧化物性半导体传感器及其阵列具有所需工作温度较高、长时间工作后基准值易发生漂移、对气体混合物种的硫化物呈中毒反应等缺点[101]。
4 结 语
无损检测技术可以实现对样品的快速准确检测,结合数据处理或图像分析技术,其可以作为农产品中真菌和真菌毒素污染的有效鉴别和检测方法。其基本能够实现自动化操作,较省时简便,因此优于传统方法。目前红外光谱检测技术和HSI技术广泛应用于农产品中真菌及毒素的检测,并具有较高的精度,然而无损检测技术还面临着一些需要解决的问题。
无损检测技术的商业化应用面临的主要问题是设备成本高、数据量大、图像处理程序冗长。此外,需要开发并选择有效且实用的分类算法。真菌及毒素检测的未来趋势是开发高性能、低成本的无损检测设备。结合不同无损技术,提供对所检测样品更加全面的信息。
无损检测技术已应用于真菌及毒素的鉴别和定量,然而这些方法的检测限尚未得到充分地研究和确定。真菌和毒素的无损检测检出限比较高,主要是样品中毒素的含量较低且分布不均匀、背景成分的干扰、设备的定位精度以及环境因素(温度、光等)等原因造成的[29]。
目前无损检测技术通常应用于玉米及小麦中真菌及毒素的检测,且多针对有限的几种真菌或毒素,在分离不同菌种时准确率较低。未来无损检测技术还需要进行深入地研究,如在短时间内对不同农产品中的多种真菌或毒素进行同时分析,利用更大的数据集和先进的化学计量学软件开发更稳健的校准模型,以及提高检测结果的灵敏度、准确性和重复性等,随着设备及仪器价格的降低和新算法的发展,这些无损快速的检测技术将对农业真菌和真菌毒素污染检测有更大的价值[3]。