杀菌方式对年糕贮藏期微生物多样性及品质的影响

孙同辉，陈 洁,*，李雪琴,*，陈 玲

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001；2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640）

以大米为原料的加工制品中，年糕是一种具有悠久历史和浓郁地方特色的半方便型传统小吃[1]，其美味醇香、口感爽滑、营养丰富，深受消费者喜爱。但在年糕加工制作过程中，原辅料、半成品和成品都可能直接与空气或水相接触，其水分含量高且富含营养，极易受到细菌侵袭而腐败变质[2]，不能适应市场流通销售的需要。近年来，随着年糕市场的不断扩大，开展年糕的贮藏保鲜研究尤为重要。沈庆霞[3]、李共国[4]等研究了高温灭菌对年糕品质及微生物的影响，结果发现调控杀菌条件可以延长货架期并保证货架期间良好的品质；蔡怀依等[5]研究了乙醇喷涂对年糕微生物及品质的影响，结果发现乙醇喷涂可以使年糕在贮藏期间保持优良品质，且该方法价廉简单，目前已在食品保鲜中得到应用。

高通量测序技术也称“下一代测序技术”，可对数百万个DNA分子同时测序，根据16S rRNA基因序列分析特定环境中微生物群落的构成情况或基因的组成以及功能特性[6-7]，近年来，已成为分析食品微生物多样性、评价食品发酵和贮藏过程中微生物群落结构变化、监测食源性病原菌动态特征以及控制食品品质等食品微生物分子生态学研究的首选方法[8-10]。虽然俞科伟[11]、胡庆松[12]、陈挺[13-14]等通过传统分离培养方法或变性梯度凝胶电泳等局限性分子生态学技术初步探索了年糕中优势腐败菌，但只能检测极少数易培养或优势微生物的变化情况，难以反映体系内微生物的真实丰度与演替规律[15-16]，且关于杀菌方式对年糕微生物菌群结构的影响还鲜有报道。基于上述情况，本研究以年糕为对象，通过贮藏期菌落变化趋势分析杀菌方式对年糕微生物的影响，采用Illumina Miseq测序平台对其16S rDNA V3～V4区域扩增子测序分析，以期更深层次挖掘杀菌方式对菌群丰富度和多样性的影响，揭示不同杀菌方式下微生物的变化规律，同时通过品质物性测定结合感官评价等方法分析杀菌方式对年糕品质的影响，为保鲜技术的探索研究和靶向抑制腐败变质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米 中粮米业（五常）有限公司；粳米 中粮米业（巢湖）有限公司。

平板计数琼脂 北京奥博星生物技术有限公司；氯化钠 天津市天力化学试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 美国OMEGA公司；Qubit 3.0 DNA检测试剂盒 美国Thermofisher公司；2×Taq Master Mix南京诺唯赞生物科技有限公司；MagicPure Size Selection DNA Beads 北京Transgen公司。

1.2 仪器与设备

高温蒸煮袋 沧州华良包装装潢有限公司；MFD15多功能一步成型机 广东衡联食品机械有限公司；400型真空（充气）包装机 郑州星火包装机械有限公司；YX280型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 上海三中医疗器械有限公司；SW-CJ-1D型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司；生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；Centrifuge 5418 R离心机 德国Eppendorf公司；DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂；凝胶成像系统美国UVP公司；TC-300聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 英国Techne公司；TA-XT plus型物性测试仪 英国Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备及分组

乙醇喷涂组样品处理参照文献[5]中方法：将体积分数75%乙醇溶液置于手持喷雾器中，均匀喷涂于年糕表面，每个年糕样品约消耗0.2 mL乙醇溶液，以每袋60 g进行包装，于25 ℃恒温箱贮藏。

水浴处理组：将样品进行包装，每袋60 g，检查无漏气或包装破损等问题，95 ℃水浴30 min，待样品冷却，于25 ℃恒温箱贮藏。

空白样品组：胶凝化后的样品直接进行包装即可，每袋60 g，于25 ℃恒温箱贮藏。

1.3.2 菌落总数测定参考GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》对年糕样品中菌落总数进行测定，每隔3 d取样测定。

1.3.3 样品总DNA提取

取空白样品组第1天、乙醇喷涂组和水浴处理组第3天的样品各3 袋，于无菌状态下剪碎混匀，每组随机取200 mg，参照基因组DNA提取试剂盒提取样品中总基因组DNA并用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，置于-20 ℃备用。

1.3.4 PCR扩增及16S rDNA测序

以提取的基因组DNA为模板，对16S rDNA序列的V3～V4区域进行扩增，引物序列上加有接头序列和测序引物序列，以适应Miseq测序平台使用，正向引物上接有不同碱基的标签序列以区分不同样品，对应引物分别为341F引物：5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG CCTACGGGNGGCWGCAG-3’；805R引物：5’-GA C T G G A G T T C C T T G G C A C C C G A G A AT T C C A GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’。

通过两轮PCR扩增并完成接头序列的连接，PCR扩增体系与扩增条件参照张皖君等[16]的方法，第一轮扩增，30 μL PCR反应体系：2×TaqMaster Mix 15 μL、10 μmol/L引物各1 μL、DNA模板10 ng，加ddH2O至30 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5 个循环；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20 个循环；72 ℃延伸5 min。第二轮扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物，DNA模板20 ng，PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5 个循环；72 ℃延伸5 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择合适的磁珠比例，用MagicPure Size Selection DNA Beads对DNA片段进行纯化回收，用Qubit 3.0检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以便于后续实验按照体积比1∶1混合后测序，Illumina Miseq高通量测序由生工生物工程（上海）股份有限公司进行。

1.3.5 年糕品质指标测定

采用TDT（Two Deformation Test）模式对年糕杨氏模量、坚实度、弹性、黏性、韧性以及咀嚼功进行测定，TDT模式模拟样品进入口腔后两次咀嚼（第一次尝试性咀嚼，到第二次破坏性咀嚼的过程）。将年糕切成9 mm长的均匀小段，按最佳蒸煮时间煮制后捞出，用蒸馏水淋洗30 s，擦干表面水分，放置在质构仪基台上，选用P/35探头。测定条件：测前、测中和测后速率均为1 mm/s，触发力负载30 g；第一次压缩，位移距离2 mm，停留时间为10 s；第二次位移距离为6 mm（将年糕压至破损）；每组样品平行测试5 次取平均值。

1.3.6 感官评价

由专业感官评定小组对年糕的色泽、弹性、口感、硬度和风味等指标进行综合评价，感官评价标准见表1。

表1 年糕感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of rice cake

1.4 数据处理与分析

用Excel软件进行数据处理，结果用平均值±标准偏差表示，采用SPSS Statistics 24软件进行单因素方差分析（P＜0.05表示差异显著），利用Origin 2017软件作图。对测序得到的数据在测序平台上进行分析。

2 结果与分析

2.1 杀菌方式对年糕贮藏过程中菌落总数的影响

图1 年糕贮藏期间菌落总数变化趋势Fig. 1 Change in total number of colonies in rice cake during storage

由图1年糕贮藏期间菌落总数变化趋势可知，年糕贮藏期间菌落总数随时间的延长逐渐增加，在0～3 d时，菌落总数增长较为缓慢，在3 d之后，样品中微生物适应新环境后迅速生长繁殖。空白样品组贮藏期间菌落总数增长迅速，在第3天时菌落总数达到5.37×104CFU/g，已超GB 7099—2015《食品安全国家标准 糕点、面包》要求（低于104CFU/g），失去食用价值；乙醇喷涂组初始菌落数为260 CFU/g，在3 d之后呈线性增长趋势，12 d时已接近104CFU/g，在15 d菌落总数达到3.16×104CFU/g；而水浴处理组0～6 d菌落总数增长速度较慢，在6 d时年糕中菌落总数为630 CFU/g，与乙醇喷涂组初始菌落总数接近，在6 d后增长迅速，在15 d时菌落总数约为7.76×103CFU/g。在贮藏过程中，水浴处理组样品的菌落总数均低于乙醇喷涂组，原因可能是乙醇喷涂虽然有较好的杀菌效果，但渗透作用较差，对年糕内部微生物菌群作用较小，在贮藏过程中微生物会逐渐适应环境而迅速生长繁殖，而水浴处理可以有效对年糕表面进行杀菌，还可以通过热传递对年糕内部产生较好的杀菌效果[18]，有效控制年糕体系中的初始菌落数，延缓年糕腐败，得到较长的货架期。

2.2 PCR扩增结果

以提取的基因组DNA作为模板，用16S rDNA V3～V4区的通用引物扩增出目的片段（图2），条带清晰，有明显主带，可以满足后续测序实验要求[19-20]。

图2 PCR扩增产物电泳图Fig. 2 Electropherogram of PCR products amplified from bacterial genomic DNA

2.3 样品中细菌菌落多样性分析结果

单样本多样性（Alpha多样性）分析可以反映微生物群落的丰度和多样性[21]，对97%相似水平下的操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）进行生物信息统计，由表2可见，所有样本的测序覆盖率均在96%以上，表明测序对样本中序列的覆盖率较高，未被测到的概率较低，满足样品中细菌多样性分析的需要[21]。

表2 年糕样品Alpha多样性Table 2 Alpha diversity of bacterial community in rice cake

采用ACE、Chao 1、Shannon和Simpon指数等多样性指标对样品微生物物种丰富度和多样性进行评估。空白样品组微生物可能主要是在年糕制作包装过程中原辅料、半成品和成品直接与空气或水接触所产生；乙醇喷涂组OTU数量减少，Simpson指数最高，Shannon指数最低，表明样品微生物多样性最低，主要原因首先可能是体积分数75%乙醇的灭菌作用明显，对菌群结构影响较大；其次，在贮藏过程中，微生物种间拮抗竞争关系筛选的优势菌群逐步成型，综合导致乙醇喷涂组菌群多样性降低。ACE和Chao 1指数较高，表明组内菌群丰富度较高；水浴处理组OTU数量增加，Shannon指数较高，Simpson指数较低，说明水浴处理组在贮藏期内检测到新的菌种，菌群多样性增加，ACE和Chao 1指数明显降低，表明菌群丰富度较低，两种杀菌方式对年糕菌群丰富度及多样性影响较大。

Shannon指数曲线可以反映在不同测序量时微生物多样性，当曲线趋于平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。由图3可以看出，所有样本的曲线都随着样品序列数量增加而逐渐趋于稳定，说明测序数据量合理，所含菌种数较多[19]。

图3 Shannon指数曲线Fig. 3 Shannon index curve

2.4 基于OTU的Veen分析结果

图4 不同杀菌方式样品中微生物物种间OTU分析的Veen图Fig. 4 Venn diagram obtained from OTU analysis of microbial species in rice cake subjected to different sterilization treatments

基于样品总OTU数量作Veen图，进行相似性分析（图4）。空白样品组与水浴处理组共有的OTU数量195 个，空白样品组与乙醇喷涂组共有的OTU数量8 7 个，水浴处理组与乙醇喷涂组共有的O T U 数量111 个，3 组样本共有的OTU数量69 个，占各样本O T U 数量比例较小，各样本特有的O T U 数量在2 145～3 015 个，各样本之间的菌群结构差异性较大，水浴处理和乙醇喷涂对年糕微生物群落结构影响较大。

2.5 杀菌方式对年糕中细菌群落结构的影响

图5 不同杀菌方式样品在科水平上微生物群落结构组成差异Fig. 5 Differences in microbial community structure at phylum level in rice cake subjected to different sterilization treatments

选取各组在科水平上最大丰度排名前7的物种，生成物种相对丰度柱形累积图[22]。由图5可以看出，空白样品组、水浴处理组和乙醇喷涂组所含微生物种类和数量有明显差异，水浴处理组和乙醇喷涂组微生物多样性低于空白样品组。

空白样品组肠杆菌科（Enterobacteriaceae）所占比例最大，为5 6.4 7%，其次为莫拉氏菌科（Moraxellaceae），所占比例为34.84%，还有芽孢杆菌科（Bacillaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae）等相对丰度较低的菌种，在年糕制作包装过程中污染微生物的种类复杂，导致样品菌落结构呈现多样性；水浴处理组在科水平下主要有Enterobacteriaceae（47.27%）、Moraxellaceae（40.75%）和Pseudomonadaceae（6.69%）和Bacillaceae（2.63%），Enterobacteriaceae相对丰度降低，Moraxellaceae相对丰度升高，Pseudomonadaceae相对丰度升高。Enterobacteriaceae耐热性较低，研究经验表明，只能通过一些手段去减少它们的存在，却不能完全将其杀灭[23-24]，其表现为相对丰度降低；Moraxellaceae相对丰度升高，因为其对环境有较好的适应能力，在缺氧和高于最适温度培养时，可以促进多形态产生[25]。水浴处理使年糕内微生物丰富度和多样性大幅度降低，尤其对温度敏感的微生物菌群，年糕中微生物菌群总数量降低，对环境有较好耐受力的菌群比例略有升高，所以表现为Moraxellaceae和Bacillaceae相对丰度略有升高；乙醇喷涂组的菌群在科水平下主要有Moraxellaceae（82.22%）、Bacillaceae（10.74%）和Enterobacteriaceae（2.8%）。Moraxellaceae中有些菌属对消毒剂有一定的抗药性[26-29]，所以呈现较高的相对丰度；Bacillaceae环境耐受能力强，可以形成孢子抵御有害环境，适应环境后繁殖迅速，表现为相对丰度略有升高，可能会成为年糕后期腐败的优势菌。

2.6 物种丰度聚类分析结果

选取丰度排名前50的属，根据其在每个样品中的丰度信息聚类绘制成热图，热图颜色变化可直观地反映出多个样本群落组成的相似性和差异性，更便于发现某些物种在样品中的聚集程度，颜色标尺中颜色越偏橙红色，表示样品中所含该物种比例越高，颜色越偏蓝色，表示比例越低。如图6所示，在属水平，水浴处理组和空白样品组聚为一类，乙醇喷涂单独聚为一类，水浴处理组和空白样品组菌群整体结构相似度较高，与乙醇喷涂组相似度较低，表明乙醇喷涂对样品菌群结构影响较大。

图6 不同杀菌方式微生物丰度聚类热图（属水平）Fig. 6 Clustering heat map of microbial abundance in race cake subjected to different sterilization treatments at genus level

图7 不同杀菌方式样品中微生物组成比例（属水平）Fig. 7 Microbial community composition in rice cake subjected to different sterilization treatments at genus level

由图7各样品中微生物组成比例可见，在属水平上，空白样品组优势菌群主要是Pantoea（36.06%）、Acinetobacter（34.55%）和Salmonella（18.1%），还有相对丰度较小的Exiguobactericm（2.48%）和Lactococcus（1.34%），空白样品中菌群分布较为均匀。在优势菌群中Pantoea所占比例最大，其属于兼性厌氧，是代谢和发酵类型的化能异养菌，为水稻内生细菌属[30-31]，主要来自于原料大米中；Acinetobacter广泛分布于外界环境中，水和土壤中居多，黏附力极强，易于随空气传播污染，在俞科伟[11]、陈挺[14]等的研究中也有检测到；Salmonella是一种常见的食源性致病菌，广泛存在于自然界[32-33]，其传播途径广泛。年糕原辅料自身携带以及加工过程中与空气、水等接触是导致新鲜样品微生物污染的主要原因[22]。

水浴处理组优势菌群主要是Acinetobacter（40.49%）、Pantoea（32.61%）和Salmonella（12.33%），还有少量的Pseudomonas（6.48%）和unclassified（3.12%）；水浴处理组样品中Acinetobacter和Pantoea菌群相对丰度依然较高，原因主要是空白样品携带Acinetobacter和Pantoea较多，水浴温度和时间条件不足以杀死体系中Acinetobacter和Pantoea菌群，有部分菌群存活下来，适应环境后迅速生长繁殖，成长为优势菌；由于Salmonella部分菌属对干燥、高盐、冷冻等恶劣环境具有极强的耐受能力，更有少数Salmonella具有较强的耐高温特性以及对其他不良环境（酸、消毒剂和辐射等）的耐受性[34-35]，所以有相对丰度接近12.33%的Salmonella菌群存活下来。

乙醇喷涂组优势菌属主要有Acinetobacter（81.46%）和Exiguobactericm（10.74%），乙醇喷涂组中菌群结构变化较大，由图8C图可得，Pantoea和Salmonella菌属相对丰度迅速降低，Acinetobacter和Exiguobactericm相对丰度升高，成为优势菌属，Acinetobacter菌属生命力极强，可长期存活，具有多重抗药性，极易对各种消毒剂和抗菌药物产生抗药性[26,36]；Exiguobactericm属于兼性厌氧菌，生境广阔，虽然不产生芽孢，但多数菌种具有一定的环境耐受性，国内外研究者们从多种多样的环境中分离得到不同的Exiguobactericm[37-40]，Acinetobacter和Exiguobactericm可能会成为乙醇喷涂组优势腐败菌。

2.7 杀菌方式对贮藏过程中年糕品质的影响

表3 年糕贮藏期间品质指标变化Table 3 Changes in instrumental quality indicators of rice cake during storage

由表3可知，随着贮藏时间的延长，年糕杨氏模量、坚实度、韧性和咀嚼功等品质指标水平呈现上升趋势，弹性和黏性逐渐降低。在贮藏期内品质变化主要是年糕老化引起的，年糕属于淀粉质食品，淀粉回生是淀粉质食品老化的主要因素，淀粉回生主要是由淀粉的再结晶引起的[41]。短期回生直链淀粉形成的晶核为支链淀粉回生提供了晶种源[42]，随着贮藏时间的延长，支链淀粉外侧短链以双螺旋为基质，通过氢键堆积结晶，直链淀粉的存在加速了支链淀粉的重结晶，使得支链淀粉在重结晶后淀粉凝胶硬度增大[43]，表现为杨氏模量、坚实度、韧性和咀嚼功逐渐增加，贮藏期间微生物生长与化学反应引起的水分含量减少，导致年糕弹性和黏性降低。空白样品组在6 d时，与0 d样品相比，黏性和咀嚼功无显著差异（P＞0.05），弹性下降12.3%，杨氏模量、坚实度和韧性显著增加（P＜0.05），分别增加26.5%、25.6%和11.2%；在0～15 d，乙醇喷涂组样品品质指标与水浴处理组呈现相同的变化趋势，弹性降低，杨氏模量、坚实度、韧性和咀嚼功均呈现上升趋势，水浴处理组15 d时较空白样品组弹性下降12.3%，杨氏模量、坚实度、韧性和咀嚼功分别上升25.4%、65.1%、23.0%和83.9%，乙醇喷涂组15 d时较空白样品组弹性下降32.9%，杨氏模量、坚实度、韧性和咀嚼功分别上升50.0%、71.5%、26.6%和52.5%，乙醇喷涂组弹性、杨氏模量、坚实度和咀嚼功变化幅度较大，原因可能是贮藏后期微生物繁殖速度较快，导致样品品质逐渐劣变，失去食用价值。因此，从质构分析结果来看，水浴处理组样品品质保持得更好。

2.8 杀菌方式对年糕贮藏过程中感官品质的影响

图8 年糕贮藏过程中感官评分的变化Fig. 8 Changes in sensory score of rice cake during storage

年糕贮藏过程中感官评分的变化见图8，年糕在色泽、弹性、口感、硬度和风味各项评分和总分均随着贮藏时间的延长而降低，随着贮藏时间的延长，年糕色泽逐渐暗淡，弹性口感变差，且特征米香味消失。贮藏前3 d，空白样品组感官评分下降明显，水浴处理组与乙醇喷涂组样品感官评分下降趋势相同，说明两种杀菌方式均能有效抑制微生物生长繁殖，延缓年糕腐败并保证年糕有较好的品质；6 d后，空白样品组有异味产生，部分样品已呈现腐败状，不具有食用价值；两组的感官评分变化趋势不同，水浴处理组在第12天时，品质保持较好，乙醇喷涂组感官评分下降速度较快，口感逐渐变差，在第12天时，略有异味产生。感官评分是判断货架期的主要指标[44]，水浴处理组较乙醇喷涂组的货架期延长，表明年糕采用水浴处理较乙醇喷涂的感官品质保持较好，水浴处理可以有效抑制微生物繁殖和油脂酸败，依据以上分析结果可以初步预测，25 ℃条件下，乙醇喷涂和水浴处理的两种年糕货架期分别可达12、15 d。

3 结 论

在25 ℃贮藏条件下，空白样品组、乙醇喷涂组和水浴处理组货架期分别为3、12 d和15 d，年糕菌落总数随着贮藏时间的延长均呈现上升趋势，水浴处理组杀菌抑菌效果较好。通过Alpha多样性和物种分类分析可知，两种杀菌方式对年糕菌群丰富度及多样性影响较大。空白样品组中优势菌属主要是泛菌属（36.06%）、不动杆菌属（34.55%）和沙门氏菌属（18.1%），乙醇喷涂组优势菌属主要是不动杆菌属（81.46%）和微小杆菌属（10.74%），水浴处理组优势菌属主要是不动杆菌属（40.49%）、泛菌属（32.61%）、沙门氏菌属（12.33%），两种杀菌方式下年糕菌群结构有较大差异，水浴处理组与空白样品组菌群相似度较高，乙醇喷涂组与空白处理组、水浴处理组相似度较低。

在贮藏期内，年糕杨氏模量、坚实度、韧性和咀嚼功逐渐上升，弹性、黏性和感官评分等呈现下降趋势，在0～15 d，乙醇喷涂组与水浴处理组样品品质变化指标变化趋势相同，杨氏模量、坚实度、韧性和咀嚼功均呈显著上升趋势（P＜0.05），弹性显著降低（P＜0.05）。综合各项测定指标的变化规律和微生物菌群结构多样性的影响，水浴处理比乙醇喷涂更适合年糕保鲜，在贮藏过程中能更好地维持年糕品质。本研究为后期靶向抑制其腐败变质和保鲜工艺的探索提供了参考。