基于低场核磁共振技术研究新微冻气调罗非鱼片水分迁移与品质变化的相关性

汪春玲，付仁豪，裴志胜，林向东，谢起斌，冯爱国,3,*

（1.海南大学食品科学与工程学院，海南 海口 570228；2.海南勤富食品有限公司，海南 海口 517300；3.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，海南 海口 570228）

罗非鱼（Oreochromis niloticus）又名非洲鲫鱼，具有生长速度快、繁殖能力强、食性杂、抗病力强等特点，是联合国粮农组织推荐的重要水产养殖品种之一。我国现已成为世界上最大的罗非鱼养殖国和供应国，据统计，2018年我国水产品总产量6 457.66万 t，其中罗非鱼产量约为162.45万 t，占世界总产量的41%左右，罗非鱼已成为我国经济鱼类之一[1-3]。

水产品在贮藏过程中的品质受多种因素影响，更易受水分含量及迁移变化的影响[4]。近年来，低场核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）及其成像（magnetic resonance imaging，MRI）技术多应用于食品，其能直观地反映食品中各状态的水分含量及变化，因食品的一些特性与水分有着密切关系，可结合品质指标对其进行相关性分析，间接反映食品品质[5-6]。有相关研究表明，利用LF-NMR技术可对产品进行品质表征。其中，张珂等[7]利用LF-NMR研究海藻糖对冻藏罗非鱼片的品质影响，发现鱼肉的横向弛豫时间T2与其持水性、Ca2+-ATPase活性和弹性等呈正相关。Tan Mingqian等[8]利用NMR技术对多次冻融的速食海参的水分进行研究，结果显示T22、A22、A23与融冰损失、持水性、硬度等指标均具有良好的相关性。因此，LF-NMR作为一种无损快速检测技术，结合理化指标检测对水产品进行品质监测是行之有效的方法。

由于冻罗非鱼片的标准出口冻品温度要求不高于-18 ℃，以保证鱼肉在贮藏期内的品质鲜度，但冷冻耗能巨大，对设备要求高，造成出口成本偏高。因此，本实验以延伸传统微冻（-4 ℃）[9]结合气调保鲜技术来达到接近冷冻（-18 ℃）鱼片的品质效果，通过LF-NMR技术监测罗非鱼片内部的水分变化，以探究不同低温贮藏下气调罗非鱼片的水分迁移变化及其品质的相关性，从而筛选出合适的部分冷冻温度条件，以期为工厂冷冻温度条件多元化及罗非鱼片贮藏提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼片购自海口某罗非鱼加工厂。

聚丙烯（polypropylene，PP）封口膜（厚度55 μm）无锡欧亚特包装材料有限公司；H S-7 P P 托盘（21 cm×13.3 cm×3.5 cm） 上海耶伦材料公司；填充气体（CO2、O2、N2） 海口金厚特种气体有限公司；硼酸 广州化学试剂厂；盐酸、三氯乙酸（纯度≥99.0） 西陇科学试剂公司；氯化钠 广州市金华大化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

NMI20-040H-I LF-NMR成像分析仪 上海纽曼公司；CR-10型色差仪 日本柯尼卡美能达公司；Oxybaby M+I O2/CO2气体检测分析仪 德国威特公司；MAP-H360复合气调包装保鲜机 苏州森瑞保鲜设备有限公司；101-3SB电热恒温干燥箱 绍兴市上虞区沪越仪器设备厂；FA2004B型分析天平 上海佑科仪器仪表有限公司；BCD-356WJ型电冰箱 青岛海尔股份有限公司；HJ-4四联磁力加热搅拌器 金坛市环宇科学仪器厂；pHS-3C型pH计 上海伟业仪器厂；JJ-2型高速组织捣碎机 上海标本模型厂；K9840凯氏定氮仪 济南海能仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼片预处理

选购130 g左右的鱼片，加碎冰后装入泡沫箱迅速运回实验室，将鱼片速冻至中心温度分别为-4、-8、-12、-18 ℃，然后进行气调包装（1 片/盒），每组15 盒，充气比例为V（CO2）∶V（O2）∶V（N2）＝6∶1∶3（经实验室前期预实验得出该比例保鲜效果更好）。将样品放入相应的中心温度贮藏，每盒装1 片，每7 d静水解冻后进行测定。

1.3.2 LF-NMR测定T2及成像

将贮藏结束后的气调鱼片置于静水（25 ℃）中解冻30 min至鱼片柔软且表面无冰珠，切取大小为3 cm×2 cm×2 cm的背部鱼肉，用聚乙烯保鲜膜包住鱼肉块，利用LF-NMR进行T2的测定，再进行成像分析。选取数据量200、弛豫时间点数400、反演方式SIRT、迭代次数10 000 000的参数对数据进行批量反演。

LF-NMR分析的条件：共振频率20 MHz、磁体强度0.52 T、线圈直径40 mm、磁体温度32 ℃。弛豫参数设置：选择CPMG序列，采样频率SW为200 kHz，模拟增益RG1为1，P1为9.00 μs，P2为18.00 μs，数字增益DRG1为3，TD为200 054，PRG为2，重复采样间隔时间TW为5 000 ms，累加采集次数NS为4，回波时间TE为0.50 ms，回波个数NECH为3 000。

利用NMR成像软件进行成像，成像参数：重复等待时间TR为500 ms，回波时间TE为18.125 ms，选择俯视图和纵切4 个层面进行保存图像，按1-PRESCAN、2-SCOUT、3-SCAN顺序完成成像。图像处理：质子密度图用NMR图像软件对其进行统一映射、滤波、伪彩，以Hotmetal类型的BMP格式进行保存。

1.3.3 汁液流失率测定

气调包装前称鱼片质量（m0/g），测定时擦去解冻后的鱼片表面的水分，称量并记录质量（mt/g）。汁液流失率按公式（1）计算[10]。

1.3.4 色差测定

色差的测定参考Gai Shengmei等[11]的方法，并稍作修改。选定鱼片中心靠下部位，使用色差仪测量L、a、b值。L值表示亮度，a、b值分别表示红绿度和黄蓝度，+a表示偏红色，-a表示偏绿色，+b表示偏黄色，-b表示偏蓝色。色差ΔE为颜色的变化程度，按公式（2）计算。

式中：L0、a0、b0表示鱼片贮藏第0天的色泽；Lt、at、bt表示贮藏第t天的色泽。

1.3.5 pH值测定

pH值的测定参考张强等[12]的方法，并稍作改动。称取10 g搅碎的鱼肉并加入100 mL纯水，磁力搅拌30 min，静置20 min，取30 mL滤液采用pH计进行测定。

1.3.6 菌落总数测定

菌落总数的测定参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[13]。

1.3.7 挥发性盐基氮含量测定

挥发性盐基氮含量测定（volatile base nitrogen，TVB-N）参考GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》中第二法（自动凯氏定氮仪法）及郭学骞等[14]的方法，并稍作修改。称取10 g捣碎后的鱼肉，放入100 mL烧杯中，加入75 mL纯水磁力搅拌30 min，静置20 min，以不加样作为空白实验，经半自动凯氏定氮仪进行测定后，用标准盐酸溶液（0.01 mol/L）进行滴定。TVB-N含量按式（3）计算。

式中：V1、V0分别表示试液组、空白组消耗盐酸标准滴定溶液的体积/mL；c表示盐酸标准滴定溶液的浓度/（mol/L）；14表示滴定1 mL盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量/（g/mol）；m表示试样质量/g；100表示计算结果的换算系数。

1.4 数据统计与分析

实验设3 次平行，采用Excel 2016软件对数据进行处理，结果取平均值。采用SPSS 23.0软件进行邓肯氏单因素显著性差异分析和皮尔逊相关性分析。采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同温度下气调罗非鱼片的水分变化

2.1.1 横向弛豫T2各峰面积的变化

图1 不同贮藏温度下气调鱼片各横向弛豫时间峰面积的变化Fig. 1 Changes in peak areas of transverse relaxation times in modified atmosphere packaged fish fillets at different storage temperatures

鱼片的水分LF-NMR图出现3～4 个峰，与其他研究结果[15-19]一致。根据T2可将鱼片中水分状态划分为结合紧密的结合水T21（0.1～10 ms）、具有一定束缚力的不易流动水T22（10～100 ms）和流动性较大的自由水T23（100～1 000 ms）。LF-NMR的峰面积能表征水分含量，其所对应的峰面积如图1所示，所有处理鱼片的自由水和不易流动水占的比例较高，结合水的比例较少。从图1A可以看出，随贮藏时间延长，4 组的总体含水量皆呈下降趋势，前7 d总峰面积下降幅度很大，在第7天时，-18 ℃贮藏组的鱼片持水能力最强，其次是-4 ℃组，而-8、-12 ℃组的鱼片含水量最低。可能的原因是短期贮藏时，高温能暂时保持鱼肉较高的品质，且冷冻干耗效应短期内差异不明显。

由图1B可知，结合水是鱼肉中与蛋白质结合最紧密的水，在贮藏的前7 d，峰面积A21呈下降趋势，说明贮藏初期鱼片结合水含量降低，表明该阶段鱼肉的品质发生劣变很快，结构逐渐松散。7～21 d内，-8、-12、-18 ℃组出现水分回升，而-4 ℃组鱼片结合水含量一直减少，说明低温有利于鱼片的长期贮藏。21 d时，4 组鱼片结合水含量出现显著性差异（P＜0.05），直到28 d时，-4 ℃贮藏的鱼片结合水含量最低，其次为-18 ℃组，-8、-12 ℃组结合水含量无显著性差异。

由图1C可知，新鲜鱼片的不易流动水含量很高，接近总含水量。贮藏初期，不易流动水含水量快速下降，说明冷冻对不易流动水影响很大。随着贮藏时间的延长，不同组别之间出现显著性差异（P＜0.05），且28 d时，-4 ℃贮藏鱼片的A22最低，-8、-12 ℃组鱼片A22居中，-18 ℃贮藏鱼片的不易流动水含量最高。

自由水是流动性最大的水，受分子间束缚力较弱。由图1D可知，第7天时，各组组间自由水含量呈现显著性差异（P＜0.05），新鲜鱼片的自由水含量低，速冻后随贮藏时间的延长，自由水含量总体呈上升趋势，与其他研究结果[4,20]一致，贮藏末期时，4 组的鱼片自由水含量为：-4 ℃组＞-8 ℃组＞-12 ℃组＞-18 ℃组。说明温度越高，自由水含量越高。

综上可得，贮藏期内，A21总体变化较小，A22逐渐减少，而A23逐渐增加，说明不易流动水逐渐向自由水转化，使得自由水的含量升高，原因可能是冷冻使得鱼肉组织之间的肌原纤维蛋白降解，结合键断裂导致水分流失。

2.1.2 不同贮藏温度下气调鱼片低场NMR成像

如图2所示，选取鱼片中心位置，将中心位置分为两层，按新鲜鱼片以及28 d时-4、-8、-12、-18 ℃ 4 组MRI图进行排列，4 种温度下的鱼片MRI图亮度有较明显的变化，新鲜鱼片颜色红黄相间，分布均匀，含水量较高。由图2颜色可得，各组鱼片含水量由大到小依次为-18 ℃组＞-12 ℃组＞-4 ℃组＞-8 ℃组，而-18、-12、-8、-4 ℃总含水量峰面积分别为5 379、5 379、5 385、5 383，无显著差异，产生这种微小差别的主要原因可能是NMR在弛豫时间测定之后进行，等待的时间较长，空气中的水分与鱼片接触，导致鱼片水分发生轻微变化，解冻时人为造成的操作误差也可能会影响鱼肉的水分。综上可得，-12 ℃与-18 ℃的气调鱼片保水性较好，这与冯爱博等[21]的研究不一致，可能是速冻预处理造成的差异。

图2 不同贮藏温度贮藏结束后气调鱼片中心的MRI伪彩图Fig. 2 Magnetic resonance imaging pseudo-color images of modified atmosphere packaged fish fillets under different storage temperatures

2.2 鱼片汁液流失率的变化

图3 气调罗非鱼片贮藏过程中汁液流失率的变化Fig. 3 Changes in drip loss rate of modified atmosphere packaged tilapia fillets during storage

汁液流失率可反映肌肉的持水能力，影响水产品感官品质，产品表面因失水引起皱瘪发黄时会影响消费者的购买欲望，因此保持产品水分在商业和市场上起关键性作用。由图3可知，整个贮藏期内4 组汁液流失率存在显著性差异（P＜0.05），贮藏温度越低，鱼片的汁液流失越少，越利于保持品质，与其他研究结果[22-23]一致，解冻鱼片汁液流失主要是冰晶刺破细胞造成的[24]。随贮藏时间延长，鱼片汁液流失率逐渐增加，可能是与鲜鱼片比较，气调包装中的二氧化碳在低温下的溶解度高于常温，与细胞液形成渗透压，导致细胞失水[25]。第7天时，-4、-8、-12、-18 ℃组鱼片在汁液流失率分别为10.23%、7.00%、9.03%、7.02%，贮藏7～21 d过程中，-8、-12、-18 ℃贮藏的鱼片汁液流失率变化平缓，而-4 ℃组上升趋势较为明显。其中主要的原因是由于-4 ℃组在贮藏过程中保持温度的稳定性较差，鱼肉中冰晶结构不稳定，不易流动水更多地转化为自由水，造成汁液损失。

2.3 不同贮藏温度下气调鱼片品质的变化

图4 不同贮藏温度下气调鱼片各品质指标的变化Fig. 4 Changes in quality indexes of modified atmosphere packaged fish fillets under different storage temperatures

食品的色泽是品质评价的重要指标之一，利用颜色能判断鱼肉的新鲜程度。由图4A可知，4 个温度下贮藏的鱼片颜色变化随着贮藏期延长而增加。第7天时，-4、-12 ℃组鱼片的ΔE出现显著性差异（P＜0.05），而-8、-18 ℃两组鱼片ΔE无显著差异；21 d时，-4、-8、-12、-18 ℃贮藏的鱼片的ΔE分别为15.68、12.45、11.77、8.90，说明-4 ℃的鱼片色泽变化最快，-18 ℃鱼片的色泽变化相对较小，而-8、-12 ℃鱼片ΔE相近，并且更接近于-18 ℃鱼片。研究过程中发现-4 ℃的鱼片在半个月左右颜色开始变暗，随后开始发白，最后颜色接近灰色，而其他3 组颜色保持较好，-18 ℃是抑制色泽变化的最佳温度，-8 ℃与-12 ℃次之。主要原因可能是温度对气体溶解度产生影响，二氧化碳酸化导致酸碱度下降，减弱了血红素与蛋白质的结合，盒中氧气加快其氧化作用，使肌红蛋白生成氧合肌红蛋白进一步生成高铁肌红蛋白，导致贮藏后期颜色产生显著性差异（P＜0.05）。

由图4B可知，除-18 ℃组的鱼片pH值总体呈下降趋势外，其他3 组鱼片的pH值呈先降后升的趋势，是由于初期肌糖原无氧酵解产生的乳酸以及ATP分解生成的磷酸根离子等使pH值下降，随着磷酸酯酶活力被逐渐增多的乳酸抑制，肌糖原不能继续分解，乳酸也不再产生，此时为最低pH值，而后期由于含氮物质不断分解生成碱性物质使pH值回升。第14天时，-4、-8、-12 ℃组鱼片的pH值分别降至6.16、6.23、6.25，显著低于-18 ℃组；14～21 d，这3 组pH值开始升高，-4 ℃组鱼片pH值上升较快，-8 ℃与-12 ℃组相对较慢。

由图4C可知，从0～14 d，4 组鱼片的TVB-N含量缓慢增长，均未超过10 mg/100 g，21 d时，4 组鱼片的TVB-N含量差异显著（P＜0.05），-4、-8、-12、-18 ℃组鱼片的TVB-N含量分别为13.72、11.62、11.06、10.36 mg/100 g，这与杨宏旭[26]的研究结果较为一致；贮藏末期，-4 ℃组已超过15 mg/100 g，而其他3 组含量均接近13 mg/100 g。根据GB/T 21290—2018《冻罗非鱼》[27]，冻罗非鱼片的TVB-N的限量为不高于20 mg/100 g，因此气调罗非鱼片在28 d的贮藏期内都是合格的。TVB-N含量的增加是因为鱼肉中的蛋白质和非蛋白质的含氮化合物在酶和细菌等作用下发生了降解，产生了氨以及胺类等挥发性碱性含氮化合物；造成4 组鱼片TVB-N含量形成差异的原因可能是低温能抑制微生物的繁殖生长，气体作用下延长酸性环境的持续，进而控制鱼肉中蛋白质被微生物分解的速率，进一步抑制挥发性盐基氮含量的增加。

如图4 D 所示， 鱼片菌落总数的初始值为2.34（lg（CFU/g）），整个贮藏期的菌落总数呈现先慢后快的增长趋势。0～14 d时，细菌生长速率较慢，原因可能是微生物对冷环境有个过渡期，减缓了细菌生长的速率；14～21 d，4 组鱼片的菌落总数出现显著性变化（P＜0.05），21 d时，-4、-8、-12、-18 ℃组鱼片的菌落总数分别为4.2 0、3.8 3、3.6 4、3.53（lg（CFU/g）），-8、12 ℃组鱼片菌落总数与-18 ℃组接近；28 d时，4 组鱼片菌落总数均未超过5.00（lg（CFU/g））。其主要原因可能是低温结合二氧化碳溶解于鱼片表面抑制了微生物生长[28-29]，达到双重抑菌效果。

2.4 不同状态水与鱼片品质指标的相关性

表1 不同状态水与鱼片品质指标的皮尔逊相关性Table 1 Correlation between water states and fish fillet quality indicators

表1 是鱼片不同状态水峰面积与品质指标的相关性分析。-4 ℃组A与汁液流失率呈显著负相关（P＜0.05）；-12、-18 ℃组总水分峰面积A与ΔE呈极显著负相关（P＜0.01），与汁液流失率呈显著负相关（P＜0.05）。-4、-12、-18 ℃组结合水峰面积A21与ΔE、汁液流失率呈显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）负相关。4 组鱼片的不易流动水峰面积A22与ΔE、汁液流失率整体上呈显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）负相关。-4、-8 ℃的自由水峰面积A23与TVB-N含量、ΔE、汁液流失率呈正相关。综上可得，不同状态水峰面积与指标之间的相关性都较高，且相关系数在0.6～1.0范围内；由相关性分析可知，不易流动水含量越少，色泽变化越大，汁液流失率越高；自由水含量越高，色泽变化越大，汁液流失越严重。主要原因是鱼肉中流失的是流动性最大的自由水，自由水流失引起色泽的改变，从而引起品质的劣变。因此，可通过测定水分含量来预测产品的品质，与Gallart-Jornet[9]、王硕[30]等的研究结果一致。

3 结 论

随着贮藏期的延长，4 组鱼片的TVB-N含量、菌落总数、ΔE、汁液流失率均呈上升趋势。贮藏末期，-4 ℃组鱼片的TVB-N含量超过15 mg/100 g，其他组均低于13 mg/100 g；色泽变化最大的是-4 ℃组，-8、-12 ℃组的色泽变化相近，且颜色接近-18 ℃的冻品。由水分迁移及水分含量分析可得，鱼片不易流动水向自由水转化，流动性逐渐增强，自由水含量增多，其中-4 ℃组的不易流动水大量向自由水转移。由相关性结果可知，总体上，3 种状态水的峰面积与ΔE、汁液流失率有显著相关性，因此，可利用LF-NMR技术检测水分快来速判定微冻气调鱼片的品质变化。综上，延伸微冻温度至-8、-12 ℃结合气调包装，其品质可与-18 ℃的冻品相媲美，又由于市场低温设备制冷温度限制，微冻温度最低限调为-12 ℃，因此可将新“微冻”温度设置为-12 ℃。