紫花芸豆抗性淀粉对高脂血症大鼠肝脏及肠屏障损伤的修复作用

刘淑婷，王 颖,2,3,*，王志辉,2，王 迪，张艳莉，佐兆杭，王浩宇，邓 薇

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；3.黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室，黑龙江 大庆 163319）

随着消费者生活方式和膳食结构改变，高脂血症患病率逐年攀升。大量数据表明，中国成年人高脂血症患病率高达18.6%[1-2]。高脂血症是心脑血管疾病如动脉粥样硬化、缺血/溢血性中风等病症的重要发病因素[3]。高脂血症是指由体内血脂代谢紊乱引发血脂异常的一类代谢综合类疾病统称，而肝脏作为身体代谢的重要器官，在调节机体能量平衡方面起关键作用[4-6]。当人体摄入和消耗的能量不平衡时，脂肪组织中过量的游离脂肪酸会将脂肪聚集在肝细胞中，使肝脏组织病变形成肝硬化、脂肪肝等病症[7]。同时，高脂血症诱发机体自由基蓄积、免疫功能紊乱、肠道菌群失调，进而损伤肠道功能。现阶段针对高脂血症及其并发症的传统方法一般采取多种降脂药物联合干预的方式，其成本高昂、毒副作用大[8-9]。因此，探寻一种可通过膳食补充降低血液中甘油三酯（triglyceride，TG）和总胆固醇（total cholesterol，TC）含量，有效改善高脂血症的天然产物具有重要意义。

抗性淀粉是指在健康人体小肠中不被吸收，但在结肠中能被微生物完全或部分利用发酵产生对人体有益的短链脂肪酸的淀粉及其降解物，具有降低餐后血糖浓度、控制体质量、改善肠道健康等生理功能[10-11]。目前，对抗性淀粉生理功能的研究主要集中在其参与糖代谢、调节肠道菌群、预防结肠癌等方面，在脂质代谢方面的研究则更偏向于高直链玉米来源的抗性淀粉，Polakof等[7]研究发现Hi-Maize 260玉米抗性淀粉能有效改善高脂血症大鼠胰岛素抵抗造成的肝脏损伤。而对于杂粮豆类抗性淀粉的降脂护肝功能，尤其是对高脂造成的肠屏障损伤修复方面研究报道较少。芸豆，作为小宗杂粮豆类，具有极高的食用和药用价值。本实验以垦区主产紫花芸豆为原材料制备抗性淀粉，以高脂血症大鼠模型为对象，研究芸豆抗性淀粉对血脂异常导致的肝脏和肠屏障损伤的修复作用，旨在拓宽芸豆的应用领域，为芸豆抗性淀粉在高脂血症疾病方面的调节作用提供理论依据及数据支撑。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

清洁级雄性Wistar大鼠，体质量（200±20）g，生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。

紫花芸豆抗性淀粉由实验室自制；高脂血症饲料北京科澳协力饲料有限公司；TG测试盒、TC测试盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒南京建成生物工程研究所；天冬氨酸转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂片、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂片、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALKP）试剂片 北京安普生化科技有限公司；D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）测试盒 苏州卡尔文生物技术有限公司；辛伐他汀片 山东鑫齐药业有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Vet Test 8008全自动生化分析仪 北京安普生化科技有限公司；A360紫外分光光度计 上海翱艺仪器有限公司；Multiskan Sky全波长酶标仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；SHP-250生化培养箱 上海森信实验仪器公司；AL104型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫花芸豆抗性淀粉的制备

工艺流程：紫花芸豆粉→碱法提取[12]→淀粉→调浆→预糊化→超声-微波协同处理[13]→压热→普鲁兰酶酶解[14]→灭酶→老化→烘干→粉碎过筛→纯化[15]→紫花芸豆抗性淀粉

操作要点： 1 ） 碱法提取： 氢氧化钠溶液（0.2 g/100 mL）浸提时间3 h，固液比1∶7；2）超声-微波协同压热酶解法制备紫花芸豆抗性淀粉：淀粉悬浮液质量分数20%，超声-微波协同反应仪温度40 ℃，微波功率300 W，超声-微波协同处理20 min后于121 ℃压热30 min，冷却后调节至pH 5，酶添加量（9 ASPU/g，以干基质量计），55 ℃恒温酶解10 h，沸水浴灭酶。老化条件：4 ℃老化24 h。纯化后抗性淀粉平均提取率为24.17%。

1.3.2 动物分组与造模

健康Wistar大鼠（雄性）48 只，饲养在动物实验专用大鼠笼中。饲养条件：模拟循环光照12 h、室温（24±2）℃、相对湿度（50±5）%。实验大鼠适应性喂养1 周，称量体质量并记录。

根据大鼠体质量随机分为6 组，即空白组、模型对照组、阳性药物组、抗性淀粉处理组（高、中、低剂量组），每组8 只。所有大鼠每天自由饮水，空白组饲喂普通饲料，其余各组饲喂高脂血症饲料，造模6 周。造模期间，每2 周剪尾取血一次，监测血清TG和TC含量（与空白组相比，其余各组大鼠血清TC、TG含量升高2～3 倍即表示模型成立）。造模成功后，空白组和模型组大鼠每日灌胃生理盐水；抗性淀粉处理组每日灌胃不同剂量芸豆抗性淀粉；阳性药物组灌胃辛伐他汀，具体灌胃剂量见表1。实验期间观测大鼠日常精神、行为状态，连续灌胃6 周后，最后一天禁食不禁水12 h，称量大鼠体质量并记录[16]。实验鼠采取肌肉注射方式麻醉后，解剖，取肝脏、腹腔脂肪、小肠黏膜等组织分别称质量并记录。按下式计算肝脏指数。

表1 实验动物灌胃药剂设计Table 1 Grouping of experimental animals

1.3.3 血清指标测定

大鼠解剖后，立即腹主动脉取血，血液样本室温静置30 min后4 ℃高速离心机离心，吸取上层血清分装于灭菌EP管，于-80 ℃保存备用。利用全自动生化分析仪测定大鼠血液TC、TG浓度以及AST、ALT、ALKP活力，采用酶联免疫吸附测定法检测血液中抗氧化酶活力、DAO质量浓度及D-LA浓度。

1.3.4 肝脏、小肠病理组织切片检测

取肝脏右小叶及小肠黏膜组织，生理盐水冲洗后吸水纸吸拭表面，于10%中性甲醛溶液固定用以制作苏木精-伊红切片，光学显微镜下观察病理组织并采集图像[19]。

1.4 数据统计分析

运用SPSS 20软件的方差分析法比较数据差异显著性，P＜0.05及P＜0.01分别表示差异显著和差异极显著，用Origin软件制作相关图表。

2 结果与分析

2.1 芸豆抗性淀粉对大鼠体质量、肝脏指数及腹腔脂肪质量的影响

图1 各组大鼠体质量、肝脏指数及腹腔脂肪质量Fig. 1 Body mass, liver index and abdominal fat mass of rats in each group

由图1A可知，各组大鼠体质量较空白组明显升高，模型组与空白组体质量差异极显著（P＜0.01），表明高脂血症大鼠建模成功。经灌胃辛伐他汀及芸豆抗性淀粉后，阳性对照组和抗性淀粉处理组大鼠体质量均明显下降；与模型组相比，芸豆抗性淀粉低剂量组大鼠体质量差异显著（P＜0.05），其余各组大鼠体质量差异极显著（P＜0.01）。由图1B可知，模型组大鼠肝脏指数与空白组大鼠相比存在极显著差异（P＜0.01）；灌胃后，与模型组大鼠相比，除低剂量组，其他各灌胃组大鼠肝脏指数较模型组不同程度升高，差异显著（P＜0.05）。由图1C可知，模型组大鼠腹腔脂肪质量较空白组大鼠存在极显著差异（P＜0.01）。经灌胃处理后，除低剂量组外，抗性淀粉中、高剂量组和阳性对照组大鼠腹腔脂肪质量较模型组相比存在显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 芸豆抗性淀粉对大鼠血脂和肝功能相关指标的影响

图2 芸豆抗性淀粉对各组大鼠血清TC、TG浓度及ALKP、AST、ALT活力的影响Fig. 2 Effect of resistant starch from purple speckled kidney beans on serum total cholesterol and triglyceride concentrations and alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase activity in each group

如图2所示，饲喂高脂饲料的模型组大鼠与空白组大鼠之间血清TC、TG浓度存在极显著差异（P＜0.01），且模型组大鼠血清ALKP、AST、ALT活力显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组大鼠血清TC、TG浓度降低，其中TG浓度差异极显著（P＜0.01），ALKP、AST、ALT活力极显著降低（P＜0.01）。抗性淀粉灌胃干预后，与模型组相比，中、高剂量组大鼠TC、TG浓度及ALKP、AST活力差异极显著（P＜0.01），ALT活力差异显著（P＜0.05）；低剂量组大鼠血清ALKP、ALT活力虽有一定程度下降，但不存在显著性差异（P＞0.05）。

2.3 芸豆抗性淀粉对高脂血症大鼠氧化应激的影响

如图3所示，高脂血症模型组大鼠血清SOD、GSH-Px活力相比于空白组大鼠极显著降低（P＜0.01），MDA浓度极显著升高（P＜0.01）。灌胃给药后，与模型组大鼠相比，各灌胃组大鼠血清SOD和GSH-Px活力显著回升（P＜0.05，P＜0.01），MDA浓度不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），但低剂量组MDA浓度差异不显著。

图3 芸豆抗性淀粉对各组大鼠血清SOD、GSH-Px活力和MDA浓度的影响Fig. 3 Effect of resistant starch from purple speckled kidney beans on serum SOD, GSH-Px activity and MDA concentration in each group

2.4 芸豆抗性淀粉对高脂血症大鼠肠屏障损伤的影响

由图4可知，模型组大鼠血清DAO及D-LA水平较空白组大鼠极显著升高（P＜0.01），灌胃后，各组大鼠血清DAO及D-LA水平较模型组呈不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），说明芸豆抗性淀粉能在一定剂量下抑制DAO及D-LA的释放。

图4 芸豆抗性淀粉对各组大鼠血清DAO、D-LA水平的影响Fig. 4 Effect of resistant starch from purple speckled kidney beans on serum DAO and D-LA levels in rats

2.5 大鼠肝脏及小肠病理组织切片观察结果

图5 大鼠肝脏病理组织苏木精-伊红染色观察结果（×100）Fig. 5 HE staining of liver tissues of rats (× 100)

由图5可知，空白组大鼠肝脏小叶组织细胞整体形态结构完整，胞核清晰可见，肝细胞围绕中央静脉以散射状规整排列形成细胞索胞间，无明显边界分隔。而模型组大鼠肝脏组织肿大变性，损伤严重。肝细胞膨大肿胀，细胞核清晰可见但分布偏离，细胞浆质间充盈着大量形状大小各异的脂肪滴空泡，可观察到大量炎性细胞浸润和脂肪性病变。灌胃处理后，辛伐他汀组大鼠肝细胞结构相对清晰完整，肝细胞索排列整齐，仅存在极少量脂滴空泡，接近空白组大鼠肝脏切片结果。与模型组相比，芸豆抗性淀粉各剂量组大鼠肝脏损伤程度显著减轻，中、高剂量组大鼠肝细胞肿胀程度改善明显，未出现明显细胞变性坏死现象，虽偶见脂肪空泡，但肝细胞索排列清晰，而低剂量组大鼠可见清晰肝细胞索但排列紊乱，空泡数量减少，但仍存在较大脂滴空泡，表明不同剂量芸豆抗性淀粉对大鼠肝脏损伤的修复程度不同。

图6 各组大鼠小肠组织苏木精-伊红染色观察结果（×100）Fig. 6 HE staining of small intestine tissues of rats in each group (× 100)

由图6可知，模型组大鼠小肠组织形态受损，肠绒毛倒伏、脱落缺失，绒毛高度降低且参差不齐；肠黏膜肌层厚度降低，间隙宽大，隐窝深度增加。灌胃给药后，各组大鼠小肠组织形态较为完整，层次分明，与模型组大鼠相比，各灌胃组大鼠小肠绒毛高度显著增加，肠黏膜间连接紧密，肌层厚度增加，隐窝深度降低，表明芸豆抗性淀粉能在一定程度减缓高脂血症对大鼠小肠黏膜机械屏障损伤。

3 讨 论

长期高脂饮食会影响肝脏代谢，打破能量平衡，破坏脂质稳态。Stancu等[20]研究发现，饮食中的饱和脂肪和过量胆固醇可能会激活小肠和肝脏的内质网应激和氧化应激，引发肝脏及肠道功能损伤。抗性淀粉被认为是功能性膳食纤维的一种，可抵抗人体小肠消化，被结肠菌群利用发酵对机体产生积极作用[21]。研究表明，多食用富含抗性淀粉等膳食纤维类食物能降低高脂血症的发病风险[22]。

临床研究发现，高脂血症与血清中TC和TG水平密切相关[23]。当血液TC、TG水平高于正常水平时，血液内附着物增多，黏稠度升高，堵塞血管造成组织缺血性坏死，诱发大鼠肥胖致使腹腔脂肪堆积。本实验测定大鼠基本状况指标及血脂水平，结果表明灌胃芸豆抗性淀粉后，中、高剂量组大鼠体质量、肝脏指数、腹腔脂肪质量显著降低。这与Lockyer等[24]的研究结果相似，该研究发现抗性淀粉能量值为一般碳水化合物热量的10%，约为8.37 kJ/g，其可作为低能量物质减少机体能量摄入。相关研究发现，抗性淀粉是3 个或3 个以上单体单元的碳水化合物聚合物，由大量的直链淀粉分子经历老化重结晶过程形成稳定的双螺旋结构，难以在体内被酶解消化，说明抗性淀粉的摄入可延缓胃排空率、缩短其在肠道运转时间、控制体内葡萄糖转化，在结肠内发酵产生短链脂肪酸，刺激胆汁酸分泌增加，干预TG和胆固醇的合成，从而降低血清TG和TC的浓度，与本实验中灌胃组大鼠血脂浓度降低结果一致，证实紫花芸豆抗性淀粉能在一定剂量下控制体质量，减轻腹腔脂肪质量，改善血脂水平。

高脂血症病发时体内产生过量脂类物质进入肝脏，肝脏超负荷运转使脂肪堆积，造成肝脏脂肪性病变，引发肝功能异常。ALKP和ALT主要分布在肝细胞中，AST分布在线粒体中，三者作为肝脏内关键的功能性酶，可从受损的肝细胞质分泌进入血液[25]，因此血液中ALKP、AST、ALT活力可衡量肝脏损伤程度。实验结果显示，与模型组大鼠相比，不同剂量组大鼠血清中ALKP、AST、ALT活力均呈不同程度下降。结合肝脏病理切片结果可知，各灌胃剂量组大鼠肝脏组织损伤程度较模型组大鼠显著减轻，说明芸豆抗性淀粉对高脂血症大鼠肝功能损伤具有一定的修复作用，可减少炎性细胞浸润，提升细胞活力。

高脂血症会引发机体游离脂肪酸和自由基增多，破坏体内抗氧化酶系统[26]，加剧肝脏氧化应激反应和脂肪酸过氧化，造成肝脏损伤。而肝脏是第一个通过门静脉获得内源性代谢产物和外源性代谢产物的器官，也是血脂与脂蛋白结合和代谢关键场所[27]，其借助肝门静脉与肠道互联，两者通过血液回流和肝肠循环的方式相互调节，使得肝脏疾病与肠屏障功能密切相关。当肠道功能受损时，肠黏膜上皮细胞紧密连接被破坏，导致机械屏障通透性增加，D-LA和DAO分别作为肠内微生物发酵产物及细胞浆中高活性酶被分泌到血液中。实验通过测定机体氧化酶活性及血清D-LA和DAO判断机体氧化应激及肠屏障损伤程度，结果表明SOD和GSH-Px活力升高，MDA水平、DAO及D-LA活力降低。分析可能是机体摄入抗性淀粉时，抗性淀粉进入结肠，产生的短链脂肪酸被机体吸收进而影响肠道激素合成。此时外源性代谢产物从肠道通过门静脉循环进入肝脏潜在地调节肝脏代谢[28]，抑制了胆固醇合成并刺激脂肪酸分解代谢，通过减少脂质过氧化物的形成，缓解机体氧化应激反应，减轻对肠道内质网应激影响，提高肠道上皮细胞活性[29]。结合小肠黏膜切片可知，芸豆抗性淀粉组大鼠小肠黏膜组织完整，绒毛高度增加，隐窝深度降低，说明一定剂量的芸豆抗性淀粉可通过清除机体自由基起到抗氧化应激作用，从而减缓高脂血症造成的肝脏损伤，近一步修复肝脏代谢障碍所致的肠屏障损伤。

综上所述，芸豆抗性淀粉具有良好的控制大鼠体质量，降低血脂，修复高脂血症大鼠肝脏及肠道屏障损伤作用，且中、高剂量组较低剂量组效果更显著。本研究可为杂粮豆类抗性淀粉在高脂血症造成的肝损伤及肠屏障修复方面的应用提供一定的理论依据及数据支持。