SN38与呋咱氮氧化物偶联物的合成及抗肿瘤活性研究

戴 一，贾晓益，宋祖荣

SN38与呋咱氮氧化物偶联物的合成及抗肿瘤活性研究

*戴 一1，贾晓益2，宋祖荣1

（1. 安徽新华学院药学院，安徽，合肥 230088；2. 安徽中医药大学药学院，安徽，合肥 230013）

SN38为喜树碱类拓扑异构酶抑制剂。本研究以羧基呋咱氮氧化物与SN38的酚羟基成酯合成制备SN38与呋咱氮氧化物的偶联物，采用griess法、MTT法及划痕实验分别测定了该偶联物的体外NO释放、抗肿瘤活性及抗肿瘤转移活性。结果显示合成的SN38与呋咱氮氧化物偶联物24 h体外释放NO达32.4%，抗肿瘤活性比SN38及SN38与呋咱氮氧化合物的混合物更强，且具有一定的抗转移活性。可见SN38与呋咱氮氧化物的偶联物表现出显著的协同效应。

SN38；呋咱氮氧化物；griess法；抗肿瘤；抗转移

7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)为喜树碱衍生物，它是喜树碱衍生物中活性最好的化合物之一，同其他喜树碱类化合物一样，通过抑制拓扑异构酶I阻滞DNA的复制而发挥抗肿瘤作用[1]，其前药即是获得FDA批准的临床用药伊立替康。伊立替康水溶性相比于SN-38有了提高，但体外活性比SN-38低100-1000倍[2]。尽管伊立替康在体内经羧酸酯酶代谢形成SN-38，但仅有使用剂量的2%~8%能转化成SN-38[3]。另外SN38不能抑制肿瘤的转移，肿瘤的转移是导致癌症患者死亡的重要因素之一，因此，SN-38的改造依然受到很大的关注。

一氧化氮（NO）作为一种气态信使分子，具有多种生理活性[4]，高剂量NO（微摩尔浓度）可以抑制肿瘤生长[5]及逆转肿瘤的耐药性[6]。在抗肿瘤转移方面，NO供体可以下调金属基质蛋白酶（MMP）[7]、N-myc下游调节基因-1（NDRG1）[8]、细胞粘附分子（CAMs）的活性及抑制肿瘤细胞表面的微泡形成等，从而阻止肿瘤的侵袭转移[9]。NO供体种类繁多，常见的为硝酸酯类，如临床上使用的硝酸甘油、硝酸异山梨酯等[10]，但硝酸酯类结构不稳定，且受撞击易爆等。现今受到关注的NO供体多为N-偶氮烯二醇类、亚硝基硫醇类及呋咱氮氧化物类[11]。由于呋咱氮氧化物在酸碱中均具有较好的稳定性，且易于制备，得到较多的应用。拼合原理是药物化学普遍采取的药物设计策略，可以起到多药协同的效果[12]。受此启示，本研究设计合成了SN38与呋咱氮氧化物的偶联物，以期达到二者的协同抗肿瘤效果、为SN38新体系研究开发提供参考。

1 仪器与试剂

Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 三合一质谱仪，BruckerACF-400型核磁共振仪，bio-rad mode680酶标仪，SN38购于阿拉丁试剂有限公司。DEME培养基、胎牛血清FBS、MTT 均购置于生工生物工程(上海)股份有限公司，其他试剂均为分析纯。受试鼠乳腺癌4T1细胞及人肺癌A549细胞来自于美国ATCC公司。

2 方法与结果

2.1 合成路线

首先合成呋咱氮氧化物2，再在EDCI、DMAP存在条件下与SN38酚羟基成酯制备出SN38与呋咱氮氧化物偶联物1，结果见图1。产物经NMR、MS确认结构。

图1 SN38与呋咱氮氧化物偶联物的合成

2.2 化合物2的合成

按文献报道[13]合成，首先以肉桂醇（10.74 g，80 mmol）为起始原料，在16 mL冰乙酸溶解后缓慢加入NaNO2饱和水溶液20 mL，控温在70 ℃以下，反应完毕，加水稀释，以乙醚萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压过滤，除去乙醚，所得产物直接用于下步反应。取上步所制化合物 (1.152 g, 6 mmol)，丁二酸酐 (900 mg, 9 mmol)，DMAP (45 mg, 0.4 mmol) 溶于60 mL二氯甲烷，室温反应过夜，反应完毕，分别用稀盐酸、冰水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩即得灰白色固体，收率为81%，TLC分析Rf约0.4（展开剂石油醚：乙酸乙酯=1：1）；1H-NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.78 – 7.64 (m, 2H), 7.64 – 7.43 (m, 3H), 5.13 (s, 2H), 2.74 – 2.53 (m, 4H)。与文献比较分析，数据相一致。

2.3 化合物1(即SN38与呋咱氮氧化物偶联物)的合成

取SN38（392 mg, 1 mmol）、化合物2 (350 mg, 1.2 mmol)、EDCI (380 mg,2 mmol)及DMAP (123 mg, 1.0 mmol)溶于20 mL二氯甲烷中，室温搅拌反应，TLC跟踪，反应完毕，反应液分别以稀盐酸及饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去二氯甲烷，粗产物过硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱（石油醚：乙酸抑制=5:1~1:1），得淡黄色固体，收率为43%， TLC分析Rf约0.6（展开剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1）；UV(MeOH) λmax(logε) 375 nm(3.53),227 nm(4.61);1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 0.95 – 1.08 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.33 – 1.44 (t, J = 7.7 Hz, 3H), 1.82 – 1.98 (ddt, J = 16.9, 14.2, 7.1 Hz, 2H), 2.81 – 2.90 (dd, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 2.98 – 3.07 (dd, J = 7.6, 5.3 Hz, 2H), 3.09 – 3.20 (q, J = 7.7 Hz, 2H), 3.88 – 3.93 (s, 1H),5.20 – 5.35 (m, 5H), 5.68 – 5.79 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 7.45 – 7.58 (m, 4H), 7.63 – 7.76 (m, 3H), 7.80 – 7.85 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.19 – 8.27 (d, J = 9.2 Hz, 1H).;13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 7.87, 14.02, , 23.18, 28.67, 29.18, 31.62, 49.41, 54.54, 66.32, 72.80, 98.10, 111.12, 114.53, 118.64, 125.21, 125.89, 127.33, 127.42, 127.61, 129.47, 131.47, 132.09, 145.42, 146.77, 147.41, 149.41, 157.61, 170.65, 171.31, 173.86; m/z(ESI-MS) 667.6[M+H]+。

2.4 SN38与呋咱氮氧化物偶联物体外NO释放[14]

2.4.1 NO 标准曲线绘制

于96孔板中分别加入不同浓度NaNO2标准溶液 (50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μM) 100 uL，复孔3个，每孔再分别加入Griess试剂（含1.0%磺胺、5.0%的磷酸、0.1% N-1-萘乙二胺盐酸盐水溶液）37℃孵育10 min，540 nm测定吸光度，得回归方程为y = 0.0404x + 0.0561，r = 0.9998。表明NaNO2在50~1.56 μM浓度范围内线性关系良好。

2.4.2 SN38与呋咱氮氧化物偶联物体外NO释放

以pH = 7.4PBS/乙腈 (1:1)混合溶剂制备50 μM浓度的化合物1、2供试液，加入半胱氨酸 (500 μM) 后37 ℃避光孵育24 h。按照2.4.1法测定各供试液540 nm的吸光度，计算24 h NO的释放程度，结果见图2A，在过量半胱氨酸存在下，24 h内化合物1、2均具有较高的释放度，分别达到32.4%和53.5%，可见化合物1的在体外均有较高的NO释放度为其抗癌活性的发挥提供了基础。

2.5 SN38与呋咱氮氧化物偶联物抗肿瘤活性研究

取对数生长期的细胞种植于96孔板中，每孔种植4000个细胞，过夜培养，以含药培养基替换培养基，继续孵育48 h，吸去含药培养基，以含MTT培养基替换，MTT浓度为1 mg/mL，继续孵育4 h，吸去MTT培养基，加入DMSO150 μL，震荡10 min，于酶标仪490 nm测定吸光度OD值，计算抑制率及IC50值。抑制率(%)=[1-(A实验组-A空白组) / (A对照组-A空白组)]´100%。化合物1、2及由化合物1和2按1：1摩尔比组成的混合物MTT结果显示（图2B、2C），化合物1和SN38及SN38+2对A549细胞IC50值分别为0.66、7.78、8.14 μM，对4T1细胞IC50值分别为0.12、3.46、0.71 μM。可见SN38与呋咱氮氧化物的偶联，显著提高了母体化合物的细胞毒性，均高于简单的SN38与化合物2的简单混合效果，为SN38的NO供体化的开发提供了依据。

A:NO释放；B：对HepG2细胞的MTT结果；C：对A549细胞的MTT结果

2.6 姜黄素与呋咱氮氧化物偶联物抗转移活性研究

在6孔板中种植4T1细胞，长至汇合度达95%~100%，用1 mL枪头轻轻在细胞上划出十字痕，以PBS洗去划掉的细胞，加入含药培养基继续培养，在0 h及24 h 分别以显微镜观察伤口的愈合。结果如图3所示，单独的SN38与对照组相似，都可见明显的划痕愈合，而SN38与呋咱氮氧化物偶联物组可见划痕未见明显愈合，说明SN38与呋咱氮氧化物的偶联物具有一定的抗肿瘤转移效果。

图3 SN38与呋咱氮氧化物偶联物抗肿瘤转移作用

3 讨论

SN38通过抑制拓扑异构酶而发挥抗肿瘤作用，在临床上已较为广泛的使用，但其在使用过程中同样会产生耐药性，其活性有进一步提升的空间，仍具有较大的开发潜力。NO作为第一个发现的气态信使分子，参与多种生理及病理过程，高浓度一氧化氮可以抑制肿瘤的增殖、转移及逆转肿瘤的耐药性。本研究通过品和原理合成了SN38与呋咱氮氧化物的偶联物，该偶联物进入细胞体内，酯键水解释放NO和原药SN38，发挥协同效果。初步体外实验显示，该偶联物可以释放NO和具有比母体更强的抗肿瘤活性，同时具有一定的抗肿瘤转移作用，值得进一步开发研究。

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SYNTHESIS AND ANTI-TUMOR ACTIVITY OF CONJUGATE OF SN38 AND FUROXANS

*DAI Yi1, JIA Xiao-yi2, SONG Zu-rong1

(1.Pharmacology College, Anhui Xinhua University, Hefei, Anhui 230088, China；2. Pharmacology College, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei ,Anhui 230013, China)

SN38 is a topoisomerase inhibitor of camptothecin alkaloids type. The conjugate of SN38 and furoxans was synthesized through esterification of furoxan containing carboxyl with phenol hydroxyl of SN38. The NO release, antitumor activity and anti-metastasis activity of the conjugate of SN38 and furoxanswere determined by Griess method, MTT method and scratch assay respectively. The results showed that the conjugate of curcumin and furoxans could be prepared. The percent of NO release from conjugate of SN38 and furoxans was 32.4%in 24 h. The anti-tumor activity of conjugate of SN38 and furoxans is more potent than those of SN38, or mixture of SN38 and furoxans. Moreover, the conjugate of SN38 and furoxans has anti-metastasis activity. These results indicated thattheconjugate of SN38 and furoxans has significant synergistic effects.

SN38; furoxans; griess method; anti-tumor; anti-metastasis

R914.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.05.005

1674-8085(2020)05-0022-04

2020-06-006；

2020-07-29

国家自然科学基金青年项目（81603362）；安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2019A0873); 安徽新华学院中药量效关系研究团队（kytd201908）

*戴 一(1979-)，男，安徽利辛人，副教授，博士，主要从事活性天然产物研究(E-mail:daiyiii@163.com);

贾晓益(1978-)，女，安徽合肥人，副教授，博士，主要从事抗炎药理研究(E-mail:jiaxiaoyi78@126.com);

宋祖荣(1977-)，女，安徽凤阳人，副教授，硕士，主要从事中医药药理研究(E-mail:szr77@126.com).