照光抑制稻曲病菌菌丝生长的转录组分析

郭宇燕，张璐，赵心雨，胡东维，梁五生

（浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所/农业部作物病虫分子生物学重点实验室，杭州310058）

稻曲病由稻曲病菌（Villosiclava virens，无性态为Ustilaginoidea virens）引发。稻曲病菌为肉座菌目、麦角菌科、绿核菌属真菌[1-2]。该菌在水稻孕穗早期侵染水稻幼穗，从花丝顶部侵入，然后朝花丝基部扩展[3]，在籽粒灌浆中后期形成稻曲球[2]。稻曲球表面可产生大量厚垣孢子[4]，还可形成若干菌核。稻曲病菌侵染水稻后会吸收寄主的营养物质用于自身生长发育，从而导致稻谷空粒，造成水稻减产[5]。此外，稻曲球还含有对人、动物和植物均有一定毒性的毒素，严重影响稻米品质[6-8]。

由于大面积推广种植的水稻品种缺乏抗性以及气候变化等原因，近年来，稻曲病的发生呈现不断加重的趋势。该病已由一种零星、偶发性病害逐渐发展成为一种水稻主要病害[6]。在我国，此病在东北、西南和长江中下游稻区危害较重，主要发生于晚稻上[6]。在其他亚洲国家或地区，以及美洲和非洲，亦有此病大面积发生的报道[9]。

稻曲病菌虽然属于活体营养型病原真菌，但不能进入寄主细胞内部，不能产生吸器类结构，侵染模式为典型的细胞外侵染和扩展，其向水稻深层组织的扩展由菌丝完成[4]。目前关于稻曲病菌菌丝生长调控的研究仍非常薄弱，对该菌菌丝的生长受到哪些因子调控及涉及的调控机制了解不多，导致研究者对该菌在水稻深层组织中扩展的调控机制不甚明确。

研究已证实照光可影响一些真菌的生长发育[10-11]，但关于照光对稻曲病菌的影响尚存在争议。有研究报道，稻曲病菌菌核在黑暗中萌发的菌丝只产生分生孢子；而在充分照光条件下萌发的菌丝可形成子实体，产生子囊孢子，表明照光对该菌的生殖过程有重要影响[12-15]。然而，液体培养菌丝的产孢过程不受照光影响，不管照光与否都只产分生孢子，且孢子产量无差异[16-17]。照光被报道可诱导固体培养菌丝产生厚垣孢子，而黑暗条件下基本不产孢[18]；另有研究给出了相反结论，即黑暗条件下可产生大量厚垣孢子，而照光条件下不产孢[19]。对于稻曲病菌菌丝，有研究报道照光可抑制其生长[19-20]，也有文献则报道照光对其无影响[17,21]。上述研究结论的诸多不一致表明，关于照光对稻曲病菌生长发育的影响尚待开展更多、更细致的研究予以明确。鉴于此，本研究比较了照光和黑暗条件下稻曲病菌菌丝在固体培养基上的生长状态，并应用转录组测序技术，比较了上述2 组菌丝的基因整体表达情况，分析了照光引起的差异表达基因。本研究的结果有助于明确照光对稻曲病菌菌丝生长的影响，增进人们对该菌菌丝生长调控机制的认识，为水稻生产中科学、高效地防控稻曲病奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验菌株与培养方法

试验材料为稻曲病菌ZJ09 菌株，从田间水稻病株上采集稻曲球并进行多代单菌落分离纯化后得到。

菌株培养方法：取马铃薯蔗糖琼脂（potato sucrose agar,PSA）培养基平板上正常生长15 d的稻曲病菌，用直径为5 mm 的打孔器沿着菌落边缘打取菌碟，接种于新的PSA 平板中央，分成黑暗组与照光组2 组，黑暗组培养于保持黑暗条件的培养箱中，照光组培养于用日光灯提供白光（光照强度为4 000 lx）的培养箱中，温度均为28 ℃。分别于培养7、15、20 d后取培养物用显微镜观察和拍照，采用十字交叉法测量菌落直径，每个时间点每组均观测6皿。凡用于测量菌落直径的PSA平板在测量完后均终止培养。用铁勺分别从培养20 d的黑暗组与照光组PSA平板上刮取菌丝，用锡箔纸包好，立即用液氮快速冷冻，随后送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行转录组测序。在转录组试验中，黑暗组与照光组均设2个重复，每个试验重复至少含3皿PSA平板培养物，作为生物学重复。

1.2 转录组试验方法

1.2.1 cDNA 文库的构建及转录组测序流程

采用Oligo（dT）磁珠法富集稻曲病菌菌丝样本总RNA 中带有多聚A（poly A）的mRNA，再加入二价金属离子溶液，将其打断成长200～300 碱基的片段。继而用6 碱基随机引物和反转录酶合成cDNA 第1 链，以第1 链cDNA 为模板合成第2 链，第2 链的cDNA 的碱基T 被替换为碱基U，获得链特异性文库。文库构建完毕后，采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增进行片段富集，再根据片段大小（300～400 bp）进行选择。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 对得到的文库进行质检，检测文库的总浓度及有效浓度。根据文库有效浓度及所需数据量，将含有不同Index 序列的文库按比例混合，统一稀释至2 nmol/L。最后，采用第2代测序 技术（next-generation sequencing），基于Illumina HiSeq 测序平台，对所得文库进行双末端测序。

1.2.2 转录组测序数据分析

上述得到的文库经上机测序，得到图像文件，再由测序平台自带软件进行转化，获得FASTQ格式的原始下机数据（raw data），统计每个样品的碱基识别准确率。将原始数据采用Cutadapt 进行过滤，去除3′端的接头，获得高质量识别序列（clean data），使用Tophat软件将其与稻曲病菌“UV-8b”参考基因组序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/31935?genome_assembly_id=59177）进行比对，默认识别序列（reads）和参考基因组序列的错配个数在2 个之内，即为比对（mapping）成功。拼接比对成功的识别序列，还原出转录本序列。

对于使用Tophat 软件比对成功的序列，利用Cufflinks-2.2.1（http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks），通过计算每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目（expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per million base pairs sequenced, FPKM）来对基因表达进行定量；利用Cuffdiff 分析模块筛选差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），筛选标准为|log2（差异倍数）|＞1，且Q＜0.05，其中，差异倍数=照光组样品基因表达量/黑暗组样品基因表达量。

随后，对筛选到的DEGs 进行基因本体（gene ontology, GO）功能显著性富集分析，把所有DEGs向GO 数据库（http://www.geneontology.org）的各个分类映射，计算每个分类的基因数目，得到DEGs显著富集的GO类别（term）。

此外，利用京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）公共数据库，使用软件KOBAS 2.0 对筛选到的DEGs 进行KEGG 通路（pathway）注释，获得通路显著性富集结果[22]。

1.3 用实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）验证转录组测序结果

以稻曲病菌的α微管蛋白-1 编码基因作为内参基因[23]，选取6 个表达丰度较高的DEGs，其中上调和下调的基因各3个（表1），进行RT-qPCR，以验证本研究中转录组测序筛选出的DEGs 的可靠性。用NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的在线引物设计工具Primer-Blast 来设计引物，引物序列见表1。用铁勺从培养20 d的黑暗组与照光组PSA平板上分别刮取菌丝，用Trizol 法提取总RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover 试剂盒（日本东洋纺公司）进行反转录，获得cDNA。用SYBR Green QPCR主混料试剂盒（日本东洋纺公司）进行RT-qPCR，仪器为Mastercycler epgradient S 型荧光定量PCR 仪（德国Eppendorf 公司）。PCR扩增体系（20 μL）：SYBR Green定量PCR主混料10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性60 s；95 ℃变性10 s，60 ℃延伸30 s，40 个循环。基因的相对表达量采用2－△△CT法计算。

表1 实时荧光定量PCR试验所用引物Table 1 Primers used in RT-qPCR experiment

2 结果与分析

2.1 照光对稻曲病菌菌丝生长的影响

对在PSA平板上培养7、15、20 d后的ZJ09菌株菌落直径进行测量，结果表明：黑暗组和照光组的菌落直径差异显著（P＜0.01），培养7、15、20 d 后照光组的菌落直径都显著小于黑暗组的菌落直径（图1）。用显微镜观察2组菌落，比较其菌落内部（非边缘区域）可以看到，2 组菌落的厚度、菌丝密度无明显差异；从菌落边缘可以看到，2 组菌落的菌丝在粗细、分支情况方面都未见明显差异（图2）。由此可得，照光组和黑暗组稻曲病菌的菌落直径有显著差异，反映出二者菌丝生长速率不同，表明照光可以明显抑制稻曲病菌菌丝的生长。

2.2 文库及转录组输出数据结果

为了从转录组水平探究照光抑制ZJ09菌株菌丝生长的机制，本试验构建了4个cDNA文库（CK_D1、CK_D2、Uv_L1 和Uv_L2），其中，文库CK_D1 与CK_D2 为黑暗组的2 个重复，文库Uv_L1 与Uv_L2为照光组的2个重复。文库质检合格后进行高通量测序。测序数据经整理、过滤后，共获得6G数据量的高质量序列，达到转录组测序对数据深度的要求。最终的序列数量、碱基数量以及识别准确率见表2。从中可以看出，高质量识别序列占比及高质量识别序列碱基占比均大于97%。

转录组测序所得序列与稻曲病菌参考基因组的比对结果见表3。从中可以看出：在4个文库测序所得序列中，能与参考基因组序列匹配的序列占比均超过85%，且仅比对到一个位置上的序列占比均超过97%。

上述结果表明，本次转录组测序结果质量优良，可用于生物信息学统计和分析。

2.3 差异表达基因的鉴定结果

对黑暗组与照光组ZJ09 菌株菌丝的转录组测序数据进行差异分析，共得到695个DEGs，其中359个被照光上调表达，336个被照光下调表达。

2.4 差异表达基因的GO 富集分析结果

GO的基本单位是类别（term），可分为生物过程（biological process）、细胞成分（cellular component）和分子功能（molecular function）3个大类别，每个大类别中包含许多亚功能类别。如图3 所示，在本试验得到的695 个DEGs 中，491 个DEGs 获得GO 富集，3个GO大类别中都有DEGs富集。在生物过程大类别中，富集较多DEGs 的GO 亚功能类别为代谢过程、含氮化合物代谢过程、生物合成过程、有机氮化合物代谢过程、细胞生物合成过程、有机物生物合成过程、蛋白质代谢过程、细胞蛋白代谢过程。在细胞成分大类别中，富集较多DEGs 的GO 亚功能类别为无膜细胞器、胞内无膜细胞器、胞内核糖核蛋白复合物、核糖核蛋白复合物、核糖体。在分子功能大类别中，富集较多DEGs 的GO 亚功能类别为氧化还原酶活性、核糖体结构成分、结构分子活性。初步可以看出，照光主要在这些GO 类别所描述的生物过程、细胞成分和分子功能方面对稻曲病菌菌丝产生了影响，从而抑制了稻曲病菌的生长速率。

图1 照光对PSA平板上ZJ09菌株菌落生长的影响Fig.1 Effect of lighting on the colony growth of ZJ09 strain cultured on PSA plates

2.5 差异表达基因的KEGG 通路注释结果

本试验所得的DEGs 被注释到152 个KEGG 通路中，富集DEGs 最显著的20 条通路见表4。在这20 条通路中，核糖体通路涉及的DEGs 有59 个，明显多于其他的KEGG 通路。但在除核糖体通路外的其余19条通路中，发现有8条通路与氨基酸代谢有关，涉及53个DEGs。上述结果说明，照光抑制稻曲病菌菌丝的生长可能与核糖体结构和功能，以及氨基酸代谢受到影响有较大关系。

图2 黑暗组与照光组ZJ09菌株菌落状态的比较Fig.2 Comparison of the colony states of ZJ09 strain cultured in dark and lighting

2.6 照光对乙酰辅酶A 合成酶编码基因表达水平的影响

对鉴定到的695 个DEGs，除利用软件进行GO富集和KEGG通路分析外，还逐一考察了每个DEG的功能。结果发现：DEGs中包含1个乙酰辅酶A合成酶（acetyl-coenzyme A synthetase,ACS）编码基因，照光组样品中ACS 编码基因的表达水平只有黑暗组样品的18.2%，说明照光对稻曲病菌菌丝中ACS编码基因的表达存在显著的抑制效果。ACS 可催化乙酰辅酶A的合成，是微生物体内乙酰辅酶A的重要来源之一。乙酰辅酶A 是生物体内物质和能量代谢的枢纽性物质。抑制ACS 编码基因的表达有可能减少生物体内乙酰辅酶A的含量，从而影响乙酰辅酶A参与的众多代谢过程。因此，推测照光抑制稻曲病菌菌丝的生长可能与其抑制ACS 编码基因的表达有很大关系。

表3 过滤后的测序数据与参考基因组序列比对结果Table 3 Mapping results of the filtrated sequencing data to sequences of the reference genome

2.7 RT-qPCR 对转录组测序验证的结果

如图4 所示，受测的6 个基因（分别对应表1 中编号2～7 所代表的基因）中，有3 个受照光上调表达，另外3个受照光下调表达；这6个基因表达的变化趋势与用转录组测序得到的结论一致，说明本次转录组测序结果的可信度很高。

3 讨论

关于照光对稻曲病菌菌丝生长的影响，有研究报道了2种不同的结论。FU等[19]和季宏平[20]分别报道了照光对稻曲病菌菌丝生长的抑制作用；吕锐玲等[17]和陆凡等[21]的研究则得出，照光对稻曲病菌菌丝生长无影响。本研究发现，照光组稻曲病菌菌丝的生长速率明显低于黑暗组的生长速率，显示照光可以抑制菌丝的生长，表明照光条件是该菌菌丝生长的调控因子之一。

为了进一步探究照光抑制稻曲病菌菌丝生长的机制，本研究还分别采集照光和黑暗条件下培养的菌丝进行转录组测序，通过比较2 组菌丝的转录组鉴定了DEGs，并对DEGs 进行了GO 富集和KEGG通路分析。这是关于照光影响稻曲病菌菌丝生长分子机制的首次报道。

乙酰辅酶A 是各类生物体中极其重要的能量及物质代谢中间产物，参与生物体内许多重要的代谢过程，比如三羧酸循环、脂肪酸生物合成，等等。在微生物体内，ACS可催化乙酸直接转化为乙酰辅酶A[24]。野生型的希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsianum）能在以乙酸、乙醇或乙醛作为碳源的培养基上存活，但ACS编码基因ChAcs1被敲除的希金斯炭疽菌不能在这些培养基上存活。当微生物在含葡萄糖的培养基上生长时，理论上葡萄糖可经过糖酵解分解为丙酮酸，而丙酮酸可以借由丙酮酸脱氢酶复合体（包含丙酮酸脱羧酶、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶）催化转变为乙酰辅酶A，因此可以不依赖ACS。然而，即使有葡萄糖作为碳源，敲除ChAcs1仍可显著改变希金斯炭疽菌中一系列碳代谢相关基因的表达，并使菌丝中的脂含量降至野生型菌株的60%[25]。VAN DEN BERG等[26]尝试将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的2 个ACS编码基因之一ACS2失活，发现酵母菌突变菌株在含葡萄糖的培养基上的生长受到抑制；进一步将2个ACS编码基因ACS1和ACS2同时失活，发现酵母菌突变菌株在含葡萄糖的培养基上也不能存活，说明即使有葡萄糖作为营养物质，酵母菌的存活也离不开ACS。上述研究表明，不管微生物利用何种碳源，ACS 都具有重要作用。本研究的结果显示：照光可显著抑制稻曲病菌菌丝中ACS 编码基因的表达，削弱菌丝的乙酰辅酶A合成能力可能是照光抑制稻曲病菌菌丝生长的机制之一。

图3 稻曲病菌菌丝差异表达基因的GO富集分析结果Fig.3 GO analysis results of the DEGs of V.virens mycelia

HOG1（high osmolarity glycerol 1）是最先从酿酒酵母中鉴定出的一种蛋白激酶，现已被证实广泛存在于各种真核生物中。HOG1 介导的信号途径参与调控真核细胞对渗透胁迫的响应[27-28]。ZHENG 等[29]敲除稻曲病菌的HOG1 编码基因UvHOG1后，发现突变体菌丝的生长明显弱于野生型菌丝，显示稻曲病菌的HOG1 可调控菌丝的生长。本试验从黑暗组与照光组稻曲病菌菌丝中均检测到UvHOG1基因的表达，但2 组菌丝中该基因的表达量无明显差异，因此该基因不属于DEG，说明照光对菌丝中UvHOG1基因的表达没有影响。因此，推测照光抑制稻曲病菌菌丝的生长与蛋白激酶HOG1无关。

表4 稻曲病菌菌丝差异表达基因的KEGG通路分析结果Table 4 KEGG pathway analysis results of the DEGs of V.virens mycelia

Bax 抑制子1（Bax inhibitor-1, BI-1）是一种在动物、植物和真菌中都存在的高度保守的细胞死亡调控因子。此蛋白能抑制细胞凋亡相关蛋白Bax诱发的细胞死亡，具有抗细胞凋亡功能[30]。XIE 等[31]敲除稻曲病菌的BI-1同源基因UvBI-1后，菌丝的生长速率有所提高。与UvHOG1基因类似，在本稻曲病菌菌丝转录组研究的结果中，UvBI-1基因不属于DEG，说明照光对菌丝中UvBI-1基因的表达没有影响，因此推测照光抑制稻曲病菌菌丝的生长与BI-1无关。

本转录组测序的结果显示，一些其他植物病原真菌致病力相关因子的编码基因在稻曲病菌中的同源基因被照光上调表达，比如DEGs包含1个CFEM（conserved fungal-specific extra-cellular membranespanning）蛋白的编码基因（UVI_02042610），其在照光组菌丝中的表达水平是在黑暗组菌丝中的23.9倍，表明照光可能显著上调菌丝中CFEM蛋白的表达。CFEM 蛋白为真菌所特有，已被证实是植物病原真菌效应子[32]。比如禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）与稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的CFEM蛋白已被证实在病原菌侵染寄主植物的过程中发挥作用[33-34]。除CFEM 蛋白编码基因外，本研究中鉴定到的DEGs还包括过氧化物酶体铜胺氧化酶编码基因、过氧化物酶体膜蛋白编码基因，二者的表达均被照光上调。已有研究表明，植物病原真菌过氧化物酶体与脂肪酸β-氧化及乙醛酸循环等代谢过程密切相关，影响许多病原真菌的致病性[35]。根据上述结果，照光可能对稻曲病菌的致病力有增强作用，后续可通过接种试验验证。

图4 转录组数据的RT-qPCR验证Fig.4 Validation of transcriptome sequencing data by RTqPCR

对粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和 裂 褶 菌（SchizophyllumcommuneFr.）等一些真菌的研究发现，照光对真菌的影响有可能通过光受体介导。目前已鉴定到一些光受体，如感应蓝光的WC-1（white collar-1）和WC-2（white collar-2），感应红光及远红光的光敏色素和视紫红质等[11,36]。WC-1 具有LOV 感光结构域，通过该结构域可以直接感受光信号的刺激。WC-1 可与WC-2 形成复合物，调控下游基因的表达，从而调控真菌的生长与产孢[37-38]。不同的真菌中，WC-1 可能具有不同的靶标基因[11]。蛹虫草菌（Cordyceps militaris）不管是否受到照光，其WC-1光受体蛋白都有一定量的表达，但若受到照光，表达量会明显增多，然后逐渐减少[39]。迄今尚未见到任何关于稻曲病菌光受体的研究报道。本试验从黑暗组与照光组稻曲病菌菌丝中均检测到1个与粗糙脉孢菌WC-1 编码基因具有较高同源度的基因（UVI_02002710）的表达，但在2 组菌丝中该基因的表达量无明显差异，因此不属于DEG，表明该基因与照光抑制稻曲病菌菌丝的生长可能无关。是否有其他光受体参与到照光对稻曲病菌菌丝的生长调控中，仍有待研究。

4 结论

在培养稻曲病菌的过程中对菌落的观测结果显示，照光可抑制菌丝的生长，光照条件是稻曲病菌菌丝的一种生长调控因子。采集黑暗组与照光组菌丝，分别进行转录组测序，比较2组菌丝的转录组后得到695 个DEGs，其中359 个被照光上调表达，336个被照光下调表达。对DEGs进行GO富集分析的结果显示：生物过程、细胞成分和分子功能这3大类别都有DEGs富集，说明照光抑制稻曲病菌菌丝的生长涉及复杂的机制。对DEGs进行KEGG通路注释的结果表明，照光抑制稻曲病菌菌丝的生长可能主要与核糖体结构和功能，以及氨基酸代谢受到影响有较大关系。DEGs包含1个ACS编码基因且照光显著抑制其表达，推测削弱菌丝的乙酰辅酶A 合成能力可能是照光抑制稻曲病菌菌丝生长的机制之一。DEGs 未包含UvHOG1和UvBI-1基因，因此，照光抑制稻曲病菌菌丝的生长与蛋白激酶HOG1及BI-1无关。