快速检测梅花鹿黏膜病病毒的免疫胶体金试纸条研究

崔鹤馨，田来明，李男，田鑫，付晓霞

（长春市农业科学院长春 130111）

鹿黏膜病（DMD）是由黏膜病病毒（MDV）引起的幼鹿严重腹泻、母鹿繁殖性障碍的疾病，不利于幼鹿的良性发育，降低成鹿的生育能力，严重时会导致鹿大量病死。既往有研究证实[1]，MDV 是导致牛发病的主要病原之一，也能造成羊、鹿等很多反刍动物染病。当下国内很多地区的鹿群养殖阶段有程度不一的MDV 感染情况，一经感染，病原长时间无法清除，以致养鹿行业承受较重损失，不利于行业可持续的发展进程，故而应予以DMD 一定重视，加大快速检测诊断方法的研究力度。

1 材料和方法

1.1 材料

1）试剂与耗材：胶体金试纸条材料套装、氯金酸；

2）仪器：搅拌器、电子天平、干燥箱、高压锅以及电镜等；

3）主要试剂类型：10%HAuCl4溶液、10%NaCl 溶液以及碳酸钾0.2mol/L 等。把以上试剂整合至容积为10mL 的离心管内，充分搅拌后用蒸馏水定容到10mL，低温（-20℃）条件下保存以备用。再把以上制备的试剂加进500mL 烧杯中，加热搅拌至完全溶解，自然冷却后，将其pH 调节到8.3，定容到500mL。

1.2 方法

首先，制备20nm 胶体金溶液。提取两个整体硅化的200mL 三角烧瓶，依次兑入50mL 四蒸水溶液，安置在搅拌器上加热处理到沸腾。而后依次加入100μL 的10%的氯金酸、2.5mL 柠檬酸钠溶液，使溶液最后颜色稳定在酒红色。针对制备好的胶体金溶液予以冷却处理后，用0.21μm 予以过滤处理，借助透射电镜观测胶体金颗粒状态。

其次，依照常规方法组装胶体试纸条。即在滴加品滴加后，溶液会自行朝向吸水板方向流动，于金标垫位置，BVD/MDV 会和胶体金探针相整合，溶液持续朝向前方流动，与BVD/MDV 相结合的金标抗体于检测线位置会结合一种抗BVD/MDV 的单抗（1B11），此时检测线上就会形成胶体金溶液汇聚情况，进而呈现出相应颜色。

再者，确定试纸条的检测线和质控线的最适宜浓度。本次试验结果表明，IgG、1F11 株单抗对应的浓度依次是1 和1.5mg/mL，且被包裹在试纸条内时，测线和质控线形态优良，色泽适中。

最后，采用免疫胶体金试纸条检测DMD。在辽宁省某鹿场养殖现场收集30 份鹿粪等设为样本，编号为1～30，各样品均取用适量鹿粪，兑入适量PBS 溶液以使其呈悬浮状态，量取180μL 溶液滴加到试纸条附带的样品垫上进行检测。针对样品内剩余溶液，取用适量，trizol 法捕获RNA 并合成cDNA，用BVD/MDV 特异性引物PCR 扩增。胶体金检测与PCR 扩增实验阶段均设置1 份阳性与阴性对照。

2 结果

2.1 胶体金溶液制备

溶液呈酒红色，清澈透亮。透射电镜检查阶段测得金颗粒大小约为20nm，均匀分布。

2.2 免疫胶体金试纸条检测DMD

PCR 扩增结果提示，阳性检出样品8 份（26.7%），阴性为22 份（73.3%）。胶体金试纸条检测结果和PCR 检测结果统一。

3 讨论

现阶段，国家相关部门已颁发了DMD/MDV 的防控计划，并在畜群层面上取得一定成效，很多防控措施是多维性的，单纯依靠疫苗接种等单一方面通常无法取而预期成效。为有效防控DMD/MDV，制定周全策略，最先做的工作便是了解病毒有关临床表现及对畜牧业形成的影响。若想要从一个畜群内彻底清除DMD/MDV 的目标范畴，需突破的难点是防控病毒侵入为感染DMD/MDV 的牲畜，为达成以上目标，通常会采用多样化的诊断检测、疫苗免疫及生物安全计划等措施。故而应从了解畜群DMD/MDV 感染状况、现行管理办法及后续阶段可能新引进的措施等方面做出判断。

胶体金颗粒内径大小影响抗体标记及后期试纸条检测环节的精确度、敏感性。既往有报道指出，伴随胶体金颗粒内径的扩增过程，胶体金探针在溶液内的安稳性有跌落趋势；但内径过小，也不利于维持金颗粒的均匀性、分散度，也会降低试纸条的稳定性。故而，在制取胶体试纸条阶段，推荐把颗粒调控为20nm，通常能取得较优良的检测结果。

本次试验研究阶段，选用柠檬酸三钠还原法制取了20nm 胶体金溶液，电镜检查提示颗粒呈圆形，直径基本上均是20nm 左右，均匀分布，提示成功制取了胶体金溶液。选择疑似MDV 感染的30 份临床样品加以检测，结果提示试纸条与PCR 阳性检出率一致，均为26.7%。并且经检测后发现，本试验研究阶段制备的试纸条特异性优良。最低能检测出103TCID50/mL 的病毒浓度，在MDV 感染检测领域中有一定推广价值。█