中药防疫香囊的应用探讨

吴洁雁，肖莘芹，林淑君，丘丹，颜显欣，马民，2*

（1.暨南大学中医学院，广东广州 510632；2.暨南大学附属第一医院中医科，广东广州 510630）

2019年末，大规模新型冠状病毒肺炎疫情暴发，肆虐全球.截至2020年9月21日24时，我国累计报告确诊病例85 297例［1］，全球累计报告确诊病例超过3 060万例，累计报告死亡病例超过95万例［2］.国家卫生健康委员会发布的《新型冠状肺炎诊疗方案（试行第八版）》［3］明确指出，此次新型冠状病毒肺炎，属于中医“疫”病范畴.回顾人类社会几千年发展史，可以说也是一部伟大的瘟疫斗争史.《中国疫病史鉴》［4］记载，从西汉到清末的2 000多年里，中国先后至少发生过321次大规模瘟疫.在没有抗生素、抗病毒制剂、疫苗的古时，对抗瘟疫，中医药发挥了重要的作用，在几千年实践中，逐渐形成了其独特而成熟的瘟疫理论体系及防治方法.中医强调治未病，认为“防”重于“治”，其中，佩戴香囊辟瘟除秽的方法被广泛应用，历经千年而不衰.故笔者通过考究关于中药香囊辟瘟除秽的历史发展，拟中药防疫香囊，预防时行疫病，并借助网络药理学研究，探讨防疫香囊发挥作用的潜在靶点基因及可能的作用机制，为中医药香囊临床防疫提供理论依据.

1 认识“瘟疫”

认识瘟疫，当从解字开始.“瘟”，《说文解字》未见此字，考其本字或为“殟”.《博雅》［5］曰“殙殟，病也.”考《集韵》［5］，“瘟”，“音温.疫也.”“疫”，《说文解字》［5］曰“民皆疾也”.《素问遗篇·刺法论》［6］曰：“五疫之至，皆相染易，无问大小，病状相似”.明清两代，中医瘟疫理论发展成熟，吴又可［7］首提“戾气学说”，认为“疫者感天地之疠气”，自口鼻而入.程国彭于《医学心悟·论疫》［8］中云：“若夫一人之病，染及一室，一室之病，染及一乡，一乡之病，染及合邑，此乃病气、秽气相传染.其气息俱从口鼻而入”.可见，瘟疫相当于现代医学具有强烈流行性的传染病，患者临床表现相似.古今学者对瘟疫致病因素及感染途径的认识，某种层面上达成一致，古则谓秽恶之气、戾气自口鼻而入，今则谓寄生虫、细菌、病毒等病原体经呼吸道传播.

2 中药香囊辟疫的历史发展

中国的香囊文化源远流长.屈原之《楚辞·离骚》诵道：“扈江离与辟芷兮，纫秋兰以为佩”.《礼记》［9］记载：“男女未冠笄者，鸡初鸣，咸盥漱，栉縰，拂髦总角，衿缨，皆佩容臭”“子事父母……左右佩用……以适父母舅姑之所”，可见古时人们佩戴香草、香花、香囊已成风俗，广泛应用于生活.宋代欧阳修《归田录》［10］中记载，官员上朝时，必先于晨在家熏衣两炉，使衣服充满浓厚香气.《武林旧事》［11］记载，后宫嫔妃每逢端午会被赏赐香囊、巧棕，其中香囊不仅用于装饰襟头，更用于在端午时节避邪驱瘟.佛教自古认为香囊可以辟邪免灾，《大般若波罗蜜多经》中记载：“随多少分香囊盛贮，置宝筒中恒随逐身恭敬供养，诸怖畏事皆自消除”［12］.香囊驱邪辟秽、防病除疫的方法，是炎黄先祖长期实践的智慧结晶，最早的记载见于先秦文献《山海经》［13］，指熏草“佩之可以已疠”.唐宋元时期，四处战乱，疫情频发，孙思邈在《备急千金要方》［14］中记载：“天无一岁不寒暑，人无一日不忧喜.故有天行瘟疫病者，即天地变化之一气也”，并提到“能以道御之”，列出33条“辟温方”，其中便有佩囊防疫的记载，如太一流金散，“三角绛囊盛一两，带心前”；虎头杀鬼丸，“绛袋盛系臂”；赤散，避瘟疫气，伤寒热病方，“置绛囊中带之，男左女右，著臂自随”.明清两代，关于瘟疫的论著较以往详尽且丰富，中医瘟疫学至此形成较完备而成熟的理论体系，其理法方药在整个中医疫病防治史上颇具代表性，医家在继承前人用药经验之基础上开始重视芳香类药物的使用.《神农本草经疏》［15］记载真降香，“烧之辟天行时气，宅舍怪异，小儿带之，辟邪恶气”.《验方新编》［16］之“辟瘟防护保身良法”加入多味辛香药物如苍术、降香、檀香、甘松、丁香、麝香等.刘奎曰：“治法于未病前，预饮芳香正气药则邪不能入”，明确表示芳香药物能除邪防病，其著作《松峰说疫》中有“除秽靖瘟丹”，由大量芳香正气药组成，“苍术、降真香、川芎……”，“倘瘟疫之乡，果能焚烧佩戴，则不觉，秽气之潜消，而沉疴之顿起矣”［17］.时至今日，香囊预防瘟疫的方法仍然被广泛应用并且疗效肯定.2003年非典型肺炎流行，呼和浩特市解放军第253医院［18］运用中药香包（含苍术、川芎、丁香、细辛等药）配合其他措施，对1 176人进行预防观察，结果无一例感染.2013年H7N9禽流感爆发，徐芝兰等［19］创制抗感通鼻香囊（含苍术、白芷、石菖蒲、草果、黄芩、黄芪等药），用于皖南山区基层部队，实现零感染，且普通上呼吸道感染发病率亦较往年同期明显减少.在2020年年初疫情快速蔓延时期，武汉市卫生健康委员会［20］亦推荐市民可每日用中药香包嗅鼻数次以提升机体免疫力，防止戾气感染.

3 自拟“防疫香囊”的组成、功效分析

基于上述有关香囊防疫的古今文献研究，可以看到，中医药香囊预防瘟疫的处方用药经验丰富，疗效肯定.有研究基于现代大数据平台古今医案云平台V2.1，挖掘并整理古今医籍中治疗瘟疫的具有代表性的方剂共115首，发现其用药具有一定的规律，使用频次排名前15位的中药依次为甘草、川芎、黄芩、苍术、葛根、桔梗、白芷、羌活、升麻、柴胡、细辛、陈皮、防风、前胡、大黄［21］.结合岭南地区气候潮湿炎热、人群易被内外湿邪所困的地域特点，以及综合观察岭南地区大部分新冠患者出现乏力、肌肉酸痛以及胃肠道不适等“湿邪困阻”的表现，以芳香化浊、健脾祛湿、扶正辟疫治法为主，制作中药防疫香囊，在疫情防控的关键期，应用于留居校内的海内外学生及老师们共计1 000人，并进行新型冠状病毒肺炎的预防观察.结果显示，自2020年3月27日至2020年8月26日共5个月，观察对象中无一例新型冠状病毒肺炎感染.该香囊主要组成药物为苍术、白术、厚朴、柴胡、羌活、川芎、白芷、大黄、石菖蒲、草果.苍术气味雄厚，辛温芳香燥湿而健脾，苦温降浊以和胃，兼能祛在表之风寒湿邪、胜四时不正之气，《玉楸药解》指苍术能“辟山川瘴疠”；白术，乃扶植脾胃、散湿除痹之要药，二术配伍祛邪扶正同施，共为君药.柴胡气味轻清，芳香疏泄，使邪自表分而解，《日华子》记载其可制“天行温疾，热狂乏绝”；羌活体轻不重，气清不浊，味辛能散，性行不止，遍达肢体，能清气分之邪；川芎味辛性阳，气善走窜而无阴凝黏滞之态，能祛一切风、调一切气，常与白芷配合使用；石菖蒲辛能开泄，温胜寒湿，凡停痰积饮、湿浊蒙蔽、胸痹气滞、舌苔厚腻垢秽者，非此芬芳利窍不能疏通，以上诸药共为臣药.大黄味苦性寒，走而不守，荡涤肠胃、推陈致新，有“斩关夺门”之力；草果辛香化浊、辟秽止呕、宣透伏邪；厚朴苦辛性温，芳香化浊，理气燥湿，苦降而破邪气之结，3味为佐使药.以上10味药等份为末，装囊佩戴于胸前，芳香化浊，健脾祛湿，扶正辟疫.

中医认为肺开窍于鼻、脾开窍于口，戾气自口鼻而入，此香囊含多种芳香辟秽药物，散发出的药物气味淡而不薄、散而不走，可通过口鼻窍吸嗅而入，作用于脾肺，又肺朝百脉、主呼吸，脾主运化，药物可再通过脾肺的作用而布散全身，使“正气内存，邪不可干”，预防戾气感染.从现代医学角度出发，这种自口鼻而入的戾气导致的瘟疫，相当于呼吸道传染病.病毒入侵时，首当其冲的是机体呼吸道黏膜屏障，所以在此截断病毒侵袭是最及时有效的.芳香类中药多具有挥发性成分，可刺激黏膜表面免疫系统进行免疫应答，阻止病毒的黏附和进入，从而预防疾病发生［22-23］.本研究推测，自拟防疫香囊的作用可能与其所含挥发性成分调节机体免疫功能有关.本研究通过查阅文献，得到防疫香囊中每味药物的主要挥发性成分，再利用网络药理学预测防疫香囊的潜在靶点基因及作用机制.

4 网络药理学预测防疫香囊预防瘟疫的潜在靶点及作用机制

4.1 材料与方法

4.1.1 数据的收集与筛选

通过查阅文献，获得防疫香囊10味组成药物的主要挥发性成分，苍术、白术主要含3β-乙酰氧基苍术酮［24-29］，厚朴主要含桉叶油［30-31］，柴胡主要含 n-十六烷酸［32-33］，羌活主要含 α-蒎烯［34-36］，川芎主要含z-藁本内酯［37-39］，白芷主要含β-榄香烯［40-42］，大黄主要含n-棕榈酸［43-44］，石菖蒲主要含β-细辛醚［45-47］，草果主要含β-蒎烯［48-49］.

利用中药系统药理学分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com），分别输入上述主要挥发性成分的名称，筛选得到挥发性成分相应的靶点蛋白.在Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）中，限定物种为人，得到所有人类靶点蛋白对应的规范的基因名称，与药物挥发性成分靶点蛋白进行比对，得到药物挥发性成分靶点蛋白规范的基因名称.通过GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/），以“epidemic”为关键词搜索与瘟疫相关的基因，得到疾病靶点信息.

4.1.2 药物挥发性成分-靶点网络的构建

依据药物挥发性成分的靶点基因数据，通过Cytoscape3.7.2软件进行可视化，得到药物挥发性成分-靶点网络图，并结合Network Analyzer分析工具中的统计算法得到的连接度（degree）、中心度值（betweenness）、亲中心度（closeness）等参数调整样式.

4.1.3 挥发性成分靶点-疾病靶点相互作用网络的构建与富集分析

取疾病靶点基因和药物靶点基因交集部分提交至STRING 平台（https：//string-db.org/cgi/input.pl），限定物种为“Homo sapiens”，得到潜在靶点基因相互作用信息表格.将表格数据通过Cytoscape3.7.2软件进行可视化，并结合Network Analyzer工具调节其节点大小和边的粗细.将STRING平台分析得到的关于Reactome Pathways的数据用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在线作图网站进行富集分析.

4.2 结果

4.2.1 药物挥发性成分-靶点网络图

10个药物挥发性成分与49个对应靶点基因构建网络关系，以中药名称命名对应的主要挥发性成分，如图1.该网络共有59个节点，143条边.连接度、中心度值、亲中心度等作为评价指标，体现在相互间的连线上，这些连接药物挥发性成分和靶点较多的节点在整个网络中起到枢纽的作用，可能是关键的挥发性成分或者靶点.其中石菖蒲、白芷、厚朴、川芎、草果、白术、苍术、大黄、柴胡的连接度都在10以上，表明这些挥发性物质与疾病的关联度都较高.

图1 药物挥发性成分-靶点网络图Fig.1 Network diagram of drug-active component-target

4.3.2 靶点相互作用网络图

将49个挥发性成分靶点基因和958个疾病靶点基因取交集得到的19个基因提交至STRING平台，交集基因如图2.隐藏网络中未连接的节点，以置信度0.400生成的文件通过Cytoscape3.7.2软件中的Network Analyzer分析工具可视化，如图3所示，该网络中存在17个节点，44条边.将JAVA算法得出的拓扑学数据按连接度和综合得分值（combined score）由高到低进行排序，依次为低聚果糖（fructooligosaccharide，FOS）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、肿瘤蛋白p53（tumor protein 53，TP53）、前列腺素合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、白细胞介素10（interleukin 10，IL-10）、细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）、RHOA蛋白（ras homolog gene family，member A，RHOA）、β2肾上腺素能受体（β2-adrenergic receptor gene，ADRB2）、阿片样物质受体（μ1 opioid receptor，OPRM1）、5-羟色胺转运体基因（solute carrier family 6 member 4，SLC6A4），在生物学网络中，高连接度的节点通常被认为是网络的枢纽.因此，预测网络图中这些靶点基因与防疫香囊发挥预防瘟疫的作用密切相关.

图2 交集基因的韦恩图Fig.2 Venn diagram of the intersection of genes

4.3.3 富集分析

将从STRING平台得到的数据按富集的基因数值（observed gene count）进行排序，得到生物过程的富集结果，取前15名，得到图4所示.前3条路径都有多个靶点基因参与，可以看出，防疫香囊预防瘟疫的靶点基因主要参与信号转导、免疫、白细胞介素4（interleukin 4，IL-4）和IL-10等信号通路的调节.

图3 潜在靶点基因相互作用网络图Fig.3 Potential target gene interaction network

图4 反应路径富集分析图Fig.4 Diagram of reactome pathways enrichment analysis

5 讨论

《素问·四气调神大论》［6］曰：“是故圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱”.佩戴中药香囊预防瘟疫，充分体现了中医未病先防的思想.古往今来，香囊防疫被广泛应用.1972年发掘的长沙马王堆汉墓一号墓出土文物中，有一具古尸手握两个香囊，另外还发现多个香囊、绢袋、绣花枕、熏炉，可初步反映楚人的用香习俗.经鉴定，上述物件内装辛夷、花椒、佩兰、藁本等香药.楚地气候暑湿，多蚊虫，多瘴气，容易发生流行病的传播.芳香药物能除湿辟秽，驱赶蚊虫，因此，可推测楚人应用香草以祭祀驱邪，除湿防虫，辟疫防病的观念已初具雏形［50］.现代研究表明，中药香囊能够调节机体免疫力，预防疾病发生.吴葆德等［51］发现儿童佩戴香囊后，临床呼吸道感染发病率降低，唾液中分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）及血清中免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）含量有不同程度的增加.

本研究利用网络药理学构建防疫香囊挥发性成分-靶点网络图，结果显示，该香囊主要挥发性成分的靶点基因共有49个，瘟疫相关基因共958个，最终得到活性化合物-疾病互作靶点基因共19个.通过分析，预测中药防疫香囊可能关键作用于FOS、TNF、TP53、PTGS2、IL-10、CDKN1A、RHOA、ADRB2、OPRM1、SLC6A4等多个靶点基因，充分体现了中药香囊多成分、多靶点的优势.从富集的基因数值上来看，防疫香囊的关键靶点基因主要集中于排名第一的信号转导过程和排名第二、三的免疫调节过程.细胞信号转导是指细胞外因子通过与其受体结合，引发细胞内的一系列生物化学反应以及蛋白间相互作用，直至细胞生理反应所需基因开始表达、各种生物学效应形成的过程，实质上就是机体内一部分细胞发出信号，另一部分细胞接收信号并将其转变为细胞功能上的变化的过程.病毒侵袭机体后，多种病毒组分、细胞成分共同参与信号转导，作用于多条信号通路，其中有些信号转导有重要的病毒抑制作用，而有些则利于病毒的生存与复制.多项现代研究靶向病毒与细胞信号转导之间的关系，以利于研发有效防治流感的药物.真核生物的细胞核含有细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡所需要的全部信息，至于细胞该进行哪一个程序，取决于外来刺激向细胞核输入了什么样的转导信号.FOS基因是主要的即刻早期基因，机体在受刺激后几分钟内即可开始表达，把外界的刺激信号转为细胞内基因表达的刺激信号，其产物c-fos对细胞增殖、分化及细胞内信号转导的传递具有重要作用［52］.TNF主要由活化的巨噬细胞、自然杀伤细胞及T淋巴细胞产生，TNF-α是一种重要的炎症因子，可通过信号转导途径与核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、白细胞介素1β（interleukin1β，IL-1β）等信号通路相互影响而参与调节炎症反应、免疫、感染、细胞凋亡等生物过程［53］.抑癌基因TP53家族实际上是转录因子，可有效调控与细胞增殖、生存、黏附、炎症等相关的基因，参与调节多种细胞信号转导通路［54］.细胞因子IL-4、IL-10、白细胞介素13（interleukin 13，IL-13）主要由Th2细胞亚群分泌，能够刺激B淋巴细胞增生并合成Ig A、Ig E、Ig G.Ig A是机体黏膜免疫系统的主要成员，可有效阻止病原体在呼吸道黏膜的附着并直接发挥免疫作用［55-57］.上述物质都能直接或间接地参与机体免疫调节功能，在免疫调节中发挥着中药的作用.因此，本研究推测中药防疫香囊可能主要通过调节病毒感染相关的细胞信号转导，促进有利于抗病毒的信号转导，提高机体免疫力，从而发挥预防瘟疫的作用.

综上所述，基于“未病先防”的理念，自拟中药防疫香囊，芳香化浊，健脾护肺，扶正辟疫，该法成本低廉、应用方便.本研究基于网络药理学研究初步预测防疫香囊可能通过多种挥发性成分，作用于多靶点，促进有利于抗病毒的细胞信号转导，提高机体免疫功能，发挥预防瘟疫的作用.具体的作用机制尚缺乏细胞实验、动物实验的验证，课题组将在接下来的实验中进一步探索，为中药香囊临床辟瘟除秽的应用提供切实科学依据.