鼠李糖杆菌GG对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究

陆婷，倪 铭，夏秀秀，刘立明，赵翠青2,，金宁一

(1．温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035；2．温州大学病毒学研究所，浙江温州 325035；3．温州医科大学药学院，浙江温州 325035；4．吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林 132101)

酒精性肝病（ALD）是指由于长期大量饮酒所导致的一系列肝脏疾病，是仅次于病毒性肝炎的第二大类肝病．酒精在肝脏中代谢可引起氧化应激，影响肝脏脂质代谢诱使脂质堆积，脂质过氧化和炎症反应会进一步引起肝细胞的炎症、坏死、纤维化以及硬化，表现为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化并最终可发展为肝癌[1]．益生菌是一类对宿主健康有益的活性微生物，早在1907年就有研究提出摄入活性微生物对人体有益的观点[2]．LGG（鼠李糖杆菌GG株，Lactobacillus Shamnosus GG Strain，简写为Lactobacillus GG或LGG），是目前应用最多的益生菌之一，我们的前期研究表明，LGG及其培养上清对酒精引起的肝损伤均有保护作用[3-4]．本研究使用LGG对小鼠连续预处理4周时间，建立小鼠急性肝损伤模型，通过实验进一步阐明了LGG对急性酒精性肝损伤保护的作用机制，即LGG对急性酒精性肝损伤的保护作用是通过调节肝脏脂质代谢实现的．

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物

选购6 – 8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重18 – 22 g，购自南京君科生物工程有限公司．饲养期间自由采食．所有动物实验均经温州医科大学动物实验中心和伦理委员会批准，许可证编号为SYXK（浙）2015-0009．

1.1.2 菌 株

鼠李糖乳杆菌GG（LGG），购于美国ATCC菌种保藏中心．

1.1.3 试 剂

MRS琼脂及肉汤培养基（海博生物），谷丙转氨酶（ALT）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），谷草转氨酶（AST）试剂盒（南京建成生物工程研究所），甘油三酯（TG）检测试剂盒（Abcam），UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（生工生物工程股份有限公司），反转录试剂盒（宝牌），SYBR-Green实时荧光定量PCR预混液（Applied Biosystems），苏木素伊红染色试剂盒（碧云天），中性树胶（索莱宝），脱脂牛奶（BD），30%丙烯酰胺（索莱宝），Trisbase（索莱宝），BCA蛋白的测定试剂盒（碧云天），RIPA裂解液（索莱宝），蛋白Marker（全式金），ECL超敏发光液（索莱宝），Loading Buffer（全式金）．

1.1.4 仪器与设备

超净工作台（Thermo Fisher Scientific），高压灭菌锅（Shenan），分析天平（Mettler Toledo），电子天平（Shimadzu），高通量组织研磨仪（新芝），离心机（Thermo Fisher Scientific），PCR仪（Thermo Fisher Scientific），生化培养器（新苗），倒置显微镜（Olympus），紫外分光光度计（Synergy Biotek），石蜡切片机（Leica），电热恒温鼓干燥箱（Blue Pard），电泳装置（Bio-Rad），转膜装置（Bio-Rad），凝胶成像仪（Bio-Rad）．

1.2 方 法

1.2.1 菌株培养

冻存菌株复苏、传代三次后，接入MRS培养基中，37℃培养24 h，4℃下6 000 r / min离心20 min，弃去上清，收集菌体．

1.2.2 动物模型的建立

选取6 – 8周龄SPF级健康C57BL/6雄性小鼠，适应性喂养一周后，将小鼠随机分为3组：对照组（Pair-Fed，PF）、酒精组（Alcohol Fed，AF）、酒精 + LGG组（AF + LGG），每组10只．实验期间小鼠正常饲喂．AF + LGG组小鼠每天给予LGG处理（灌胃1 × 109CFU / 只），PF组和AF组小鼠每天给予MRS培养基处理，连续4周．实验期间每周记录小鼠体重．各组小鼠禁食16 h后，实验最后一天清晨，AF组和AF + LGG组小鼠采用50%（V/V）的酒精按6 g / Kg的剂量灌胃，建立小鼠急性肝损伤模型，PF组给予等热量的麦芽糖糊精．酒精或麦芽糖糊精处理6小时后处死小鼠，收集小鼠血清、肝脏组织以备后期实验使用．采血后迅速剖取肝脏，用冷生理盐水洗净，滤纸吸湿后称取肝脏湿重，计算肝系数．肝系数 =（肝脏质量 / 体总质量）×100%．

1.2.3 血液生化分析

小鼠外周血置4℃离心机中，3 000 r / min离心15 min，收集上层血清．分别参照试剂盒操作说明书，检测各组小鼠外周血血清中ALT和ALT的含量．

1.2.4 肝脏甘油三脂检测

称取适量肝脏组织，置于NP40 / ddH2O混合液中，使用组织匀浆机研磨组织后，参照试剂盒操作说明书测定肝脏组织中甘油三脂的含量．

1.2.5 肝脏组织病理组织学分析

新鲜肝脏组织用福尔马林溶液固定，经脱水透明、浸蜡包埋、切片后，对肝脏组织切片进行脱蜡、脱苯、复水和H&E染色．在光学显微镜下观察肝脏组织的病理学变化．

1.2.6 总RNA的提取及qRT-PCR的检测

参照试剂盒操作说明书，采用Trizol法提取肝脏组织的总RNA，并利用反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA，最后对肝脏组织中脂质合成和分解相关基因的mRNA表达水平进行RT-PCR分析．

1.2.7 蛋白质免疫印迹分析

参照RIPA组织裂解液操作说明书，提取肝脏组织总蛋白后，参照BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书测定蛋白浓度．取30 μg蛋白样品进行白质免疫印迹（Western Blot）分析，使用Bio-Rad成像系统进行显影成像，使用Image Lab 4.1 programs软件进行特异性条带定量分析．

1.2.8 统计学分析

各组数据均采用平均值 ± 标准误差（mean ± SEM）表示，统计学处理采用GraphPad Prism 7.00软件分析，两组数据间的统计分析采用独立样本t检验．*P< 0.05、**P< 0.01、***P< 0.001分别表示有统计学差异、统计学有显著差异和统计学有极其显著的差异．

2 结 果

2.1 LGG预处理缓解酒精引起的肝脏损伤

研究发现，与正常组相比，酒精组小鼠肝系数有所升高；与酒精组相比，酒精 + LGG组小鼠肝系数有所降低，但是均没有统计学意义（图1A）．外周血中丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的含量是评估肝脏损伤的重要指标，本研究为了探究LGG对小鼠急性酒精肝损伤的影响，对小鼠外周血中ALT和AST的含量进行了分析，结果如图1B、图1C所示．

从图1中可以看出，与对照组相比，酒精组小鼠外周血中ALT、AST的含量显著升高，LGG预处理可显著降低酒精引起的小鼠外周血中ALT的升高，这说明LGG预处理可以显著缓解酒精引起的肝脏损伤．

2.2 LGG预处理缓解酒精引起的肝脏脂质堆积

组织学研究显示，饮酒会引起肝脏脂质的堆积．为了探究LGG预处理对小鼠肝脏脂质堆积的影响，我们通过观察急性酒精肝脏损伤模型中小鼠的肝脏组织病理切片，发现酒精组小鼠肝细胞内有大量脂滴浸润，但是用LGG预处理后再给予小鼠急性酒精处理，小鼠的肝细胞内脂滴浸润大幅度减少，几乎恢复至对照组状态（图2A）．甘油三酯（TG）是人体内含量最多的脂质，为了量化图2A中观察到的小鼠肝脏脂质堆积情况，我们检测了各组小鼠肝脏中TG的含量，如图2B所示，可以看出，与对照组小鼠相比，酒精组小鼠肝脏组织中的TG含量显著升高，LGG预处理可显著降低酒精引起的小鼠肝脏组织中的TG含量的升高．

2.3 LGG预处理对肝脏脂肪合成的影响

FAS、SCD1和ACC1在肝脏脂质合成中扮演着重要的角色．以上研究表明，LGG预处理能够缓解酒精引起的肝脏脂质堆积，为了确认LGG预处理对肝脏脂质代谢相关基因的表达情况，我们对各组小鼠肝脏中FAS、SCD1和ACC1的mRNA水平和蛋白水平进行了检测．研究发现，与对照组相比，酒精组小鼠肝脏中FAS、SCD1和ACC1的mRNA水平以及FAS和SCD1的蛋白水平均显著升高；与酒精组相比，LGG预处理后，FAS和SCD1的mRNA水平以及FAS和SCD1的蛋白水平均显著降低．结果表明，LGG能够有效缓解酒精引起的肝脏脂肪合成（图3）．

2.4 LGG预处理对肝脏脂肪酸β-氧化的影响

为了进一步验证LGG预处理对肝脏脂肪酸β-氧化的影响，我们分析了各组小鼠肝脏组织中脂肪酸β-氧化的相关基因CPT1、PGC1α和PPARα的mRNA水平和蛋白水平，如图4所示．可以看出，与对照组相比，酒精组小鼠肝脏中CPT1和PGC1α的mRNA水平以及CPT1的蛋白水平显著降低；与酒精组相比，用LGG预处理后，小鼠肝脏中CPT1和PGC1α的mRNA水平以及CPT1的蛋白水平显著升高，进一步表明，LGG能够改善酒精引起的肝脏脂肪堆积状况．

图3 各组小鼠肝脏组织中FAS（A）、SCD1（B）和ACC1（C）的mRNA水平以及FAS（D）和SCD1（E）的蛋白水平

3 讨 论

ALD是一种常见的肝损伤形式，近30年来，随着国民经济的发展，酒精消费呈现爆炸性增长，ALD的发病率呈逐年上升的趋势[5]．由于ALD患者缺乏预防和治疗意识，ALD往往会演变为不可逆转的肝脏损伤，如肝硬化，甚至肝癌[6]．益生菌具有抗氧化、调节肠道菌群以及改善肠道屏障功能等作用[7]，近年来越来越多的研究表明，LGG可以用于预防和治疗肝脏疾病[6-9]．同时，已有研究表明，LGG及其培养上清均能改善慢性酒精诱导的肝脏损伤状况[10]，另外有研究指出，LGG培养上清预处理5天能够缓解酒精引起的肠道通透性增加，改善肝脏损伤状况[4]．本研究通过给予小鼠连续4周的LGG处理、然后酒精灌胃来模拟人们的日常生活习惯，对LGG在急性肝损伤中的保护作用进行了研究．

临床中通常通过检测ALT和AST等水平的变化来进行肝功能的评价．我们使用一次性灌胃的方法建立了小鼠急性肝损伤模型，研究发现，酒精处理后，没有接受LGG预处理的小鼠外周血中ALT和AST的水平显著升高，而接受了LGG预处理的小鼠外周血中ALT的含量增加不明显，说明LGG对急性酒精肝损伤有预防保护作用．

图4 各组小鼠肝脏组织中CPT1（A）、PGC-1α（B）和PPARα（C）的mRNA水平以及CPT1（D）、PGC-1α（E）和PPARα（F）的蛋白水平

急性酒精性肝损伤受多种因素影响，本研究发现LGG预处理可显著降低急性酒精引起的肝脏TG含量的增加．肝脏主要通过以下几个方面维持脂质代谢平衡：肝细胞甘油三脂的合成，肝细胞内脂肪酸的β-氧化，肝细胞摄取有力的脂肪酸以及通过极低密度脂蛋白的形式输出甘油三酯．通过分析肝脏脂肪合成重要基因FAS、SCD1和ACC1以及脂肪酸β-氧化关键基因CPT1、PGC1α和PPARα的mRNA水平和蛋白水平，发现LGG可以抑制肝脏脂肪合成基因的表达并促进脂肪酸β-氧化基因的表达．综上，LGG是通过调节肝脏脂质代谢而对酒精性肝病实现预防保护作用的，这为LGG在预防和治疗酒精性肝脏疾病方面的应用提供了理论依据．