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基于网络药理学及分子对接技术探讨夏枯草治疗甲状腺癌的作用机制

2020-11-26涂星强张晶晶彭小彬杜国能许礼笑子许永辉肖玉根

岭南现代临床外科 2020年5期
关键词:夏枯草甲状腺癌靶点

涂星强,张晶晶,彭小彬*,杜国能,许礼笑子,许永辉,肖玉根

夏枯草(Prunella vulgaris)主要含有黄酮类化合物、五环三萜、有机酸类物质、多糖和挥发油[1-5],其提取物具有多种生物活性,包括调节肿瘤转移的微环境、抗氧化作用和抗炎作用[1,6,7]。PVL 还可以抑制人肝癌细胞的迁移和侵袭,下调B细胞淋巴瘤蛋白2(Bcl-2)和促血管新生血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达水平,因此是治疗胃癌的有效抗癌药物[8]。夏枯草提取物还具有抗雌激素的特性,可作为治疗雌激素依赖性肿瘤的药物[9]。PVL多糖通过抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达和BC 细胞的生长而抑制人乳腺癌相关成纤维细胞(CAFs)[10]。由于夏枯草成分复杂,其主要有效成分及作用机制尚不清楚。

近年来,随着系统生物学的普及,网络药理学已成为分析中药复杂成分作用机制的重要手段。它是一种基于药物、疾病、靶点相互作用网络的系统分析方法,从整体揭示药物的作用机制,具有整体、协同等特性,这些特点与中医治病理论相吻合。本研究运用网络药理学的方法研究夏枯草治疗甲状腺癌的作用机制,为其进一步应用于甲状腺疾病的治疗提供科学依据。

1 分析方法

1.1 夏枯草主要活性成分及对应靶点预测

利用 TCMSP 数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索夏枯草的化学成分,选择口服生物利用度(OB)≥30%及类药性(DL)≥0.18 的成分作为有效成分,并下载相应的化学结构,以MOL2格式保存。

1.2 活性成分及疾病靶点库的构建

通过 TCMSP 及 PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索夏枯草中所有活性成分对应靶点,去除重复基因,得到夏枯草主要活性成分对应的靶点库。利用GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/)及 OMIM 数据库(https://omim.org/)收集甲状腺治疗甲状腺癌的靶点,检索词为“thyroid cancer”,去除重复基因,得到相应的靶点库。

1.3 PPI 网络构建

为了进一步研究夏枯草作用靶点及疾病靶点在蛋白水平的作用机制,我们采用R 语言获取两者间的交集,并利用R 包VennDiagram 进行可视化,然后将交集基因输入到STRING 数据库(https://string-db.org/),获取蛋白间的相互作用信息,并通过R 语言进行拓扑学分析及可视化。

1.4 GO 和 KEGG pathway 分析

为进一步研究核心靶点功能及夏枯草在治疗甲状腺癌中的主要作用通路,利用R 包clusterProfiler 对上述取得的药物和疾病的交集靶点进行GO和 KEGG pathway 分析,设定阈值P<0.05,q<0.05,保留P 值最小的20 个结果进行可视化。

1.5 构建“活性成分-靶点-疾病”网络

为了分析活性化合物、候选靶标以及甲状腺癌之间的相互关联,利用Cytoscape 3.7.2 构建活性成分-靶点-疾病网络。采用Nerwork Analyzer 功能进行拓扑学分析,得到核心化合物。

1.6 分子对接

选取PPI 网络中degree 值前10 的靶点作为核心靶点,用Autodock Vina 对核心靶点及相应的化合物进行分子对接,从而验证核心靶点与夏枯草主要活性成分的结合强度。

2 结 果

2.1 夏枯草主要活性成分

根据筛选条件(OB≥30%,DL≥0.18),筛选得到夏枯草11 个主要活性成分,详细信息见表1。

表1 夏枯草主要活性成分信息

2.2 活性成分及疾病靶点库的构建

通过TCMSP 和PubChem 数据库检索得到了夏枯草180 个活性成分靶点,并通过UniProt 数据库将这些靶点转换为基因名称。通过检索Gene-Cards 和OMIM 数据库,得到752 个甲状腺癌相关的作用靶点。

2.3 PPI 网络构建

利用R 语言获取活性成分靶点和疾病靶点的交集(共91 个),并用R 包VennDiagram 进行可视化(图1),然后将交集靶点输入到STRING 数据库,得到靶点间的相互作用信息,并R 语言进行拓扑学分析及可视化。如图2 所示,纵坐标代表靶点基因名称,横坐标代表连接度大小,显示degree值前30 基因。

2.4 GO 和 KEGG pathway 分析

通过R 包clusterProfiler 对交集靶点进行GO(如图3)和KEGG pathway(如图4)分析。GO 功能富集分析得到GO 条目个(q<0.05),其中生物过程(BP)条目1957个,主要包括氧化应激、细胞凋亡等方面;细胞成分(CC)条目38 个,主要包括细胞膜、细胞器、核质等方面;分子功能(MF)条目106个,细胞因子活性、受体配体结合、酶调节活性等方面。KEGG pathway 分析(q<0.05)共获得149 条通路,图4 显示前15 条为核心通路,主要有Toll 样受体信号通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路,P53 信号通路等等,这些通路皆与肿瘤相关,表明夏枯草可以通过作用于不同的信号通路治疗甲状腺癌。

2.5 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络图

根据上述结果,利用Cytoscape 3.7.2 构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络(图5)。如图所示,三角形代表夏枯草有效成分,圆形代表作用靶点,六边形代表药物,菱形代表疾病。用Nerwork Analyzer分析可知,槲皮素degree 值为82,显著高于其他有效成分,其次是木犀草素、山奈酚、谷甾醇。同时网络图显示多个靶点与不同有效成分有联系,体现了中药治疗“多成分-多靶点“的作用特点。

2.6 分子对接

基于PPI 网络,我们选择degree 排名前10 作为核心靶点于相应化合物进行分子对接。分子对接得分越低,代表亲和力越强。一般认为,docking score<-7 表明靶点与活性成分具有很好的结合活性,docking score<-5 表明靶点与活性成分具有较好的结合活性,结果见表2。由表2 可知,夏枯草4 个核心成分与甲状腺癌相关靶点的结合性均较好。我们对得分最低的3 组靶点与化合物基因进行展示(图6)。

表2 核心靶点-化合物分子对接打分结果

3 讨 论

甲状腺癌是最常见的一种内分泌系统肿瘤,在中医中它属于瘿瘤”病的范畴,主要以“软坚消瘿”为主。《神农本草经》记载夏枯草具有“散瘿结气”之功效。研究表明,夏枯草具有抑制肿瘤细胞增殖(包括甲状腺肿瘤)、诱导凋亡、调节免疫等作用[8-12]。但由于中药成分复杂,其主要有效成分及相关机制尚不清楚。

网络药理学是运用系统生物学、高通量筛选等技术,系统分析“中药成分-疾病-靶点”相互作用网络,从整体上揭示中药对机体疾病的干预和影响,与中药治病理论相吻合。本研究采用网络药理学对夏枯草治疗甲状腺癌的主要活性成分、作用靶点及所涉及的功能通路进行了初步探索。结果表明:夏枯草治疗甲状腺癌的主要有效成分的有11 个,包括谷甾醇、山奈酚、二十八烷醇、豆甾醇、飞燕草素、木樨草素、仙人掌黄素-Ⅰ、单葡萄糖苷、豆甾-7-烯醇(桑黄素、槲皮素,用Cytoscape 3.7.2对活性成分-靶点-疾病网络分析可知,槲皮素degree 值为82,显著高于其他有效成分,其次是木犀草素、山奈酚、谷甾醇,且研究表明槲皮素对治疗髓样和乳头状人甲状腺癌有明显疗效[13];木犀草素、山奈酚对各种人类甲状腺癌细胞系具有有效的抗增殖活性[14];谷甾醇也可以通过抑制细胞增殖抗肿瘤[15],提示这四种成分极有可能是夏枯草发挥抗甲状腺癌的核心药效成分。这些有效成分作用于甲状腺癌的91 个靶蛋白,PPI 网络显示,连接度前10的基因为AKTI、VEGFA、CASP3、MYC、JUN、MAPK8、IL6、EGFR、MAPK1、EGF,研究表明,这些靶点都与肿瘤细胞的增殖和分化以及肿瘤进展有关。如AKT1 调控细胞增殖和生长,参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程[16,17];VEGFA(血管内皮生长因子A)在许多肿瘤上表达,与肿瘤分期与进展有关[18,19];MYC 基因家族及其产物可促进细胞增殖、永生化、去分化和转化等,在多种肿瘤形成过程中处于重要地位等[20,21]。因此,它们可能是夏枯草治疗甲状腺癌的关键靶点。分子对接结果表明,关键靶点对应关键成分结合法强度均较好。进一步验证了夏枯草可能通过这些核心药效成分作用于相应的靶点对甲状腺癌的治疗发挥作用。

KEGG pathway 分析表明,夏枯草治疗甲状腺癌的潜在作用机制多集中于细胞增殖、分化及抗炎免疫方面。其中Toll 样受体信号通路可以通过不同的识别途径活化多种免疫细胞,启动非特异性免疫应答并激起适应性免疫应答以清除病原体,在炎症、免疫细胞调控、存活和增殖方面发挥着关键作用[22,23];TNF 信号通路促进细胞存活和分化以及免疫和炎症反应[24];PI3K-Akt 信号通路参与细胞增殖、凋亡、周期调控等病生过程[25];p53 是主要的细胞凋亡信号通路之一,可通过与细胞质中的Bcl-2 家族蛋白相互作用来促进细胞凋亡等[26]。因此,夏枯草可能通过多通路治疗甲状腺癌。

综上所述,本研究运用网络药理学和分子对接技术阐明夏枯草可以通过多成分、多靶点、多通路对甲状腺癌的治疗发挥作用。然而本研究是基于网络数据对夏枯草治疗甲状腺癌的作用机制进行的分析,故仍需进一步的体内外实验来验证我们的发现。

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