成人过敏性紫癜肾炎外周血Treg/Th17细胞轴表达与中医证型的相关性＊

薛 雪，柳 强，王小琴＊＊，袁 军，韩四萍

（1. 湖北中医药大学第一临床学院 武汉 430061；2. 湖北省中医院肾病科 武汉 430061）

过敏性紫癜是全身免疫性小血管炎，临床特点为紫癜样皮疹，常伴关节和消化道症状，出现肾脏受累称为过敏性紫癜肾炎(Henoch-schonlein purpura nephritis,HSPN)，主要表现为血尿和（或）蛋白尿，甚则肾功能损伤[1]。HSPN 是一种常见的继发性肾病，所有年龄段均可发生，好发于儿童，在儿科疾病中被认为是一类典型的自限性疾病，成人发病则不然，病情较患儿严重，肾脏受累后会尤其明显[2]。流行病学资料显示，成人HSPN 发病率呈上升趋势，病情复杂，易反复发作，治疗棘手。目前该病发病机制仍不明确，现代医学治疗亦存在争议，有限的几项随机对照研究结果显示皮质激素、免疫抑制剂及支持治疗效果并不理想[3-5]。因此进一步研究该病的发病机制并寻求有效的中西医结合治疗手段十分必要。

调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg cell)和辅助性T 细胞 17(T helper 17 cell,Th17 cell)是 CD4+T 淋巴细胞来源的亚群，对维持机体免疫平衡至关重要[6]。Treg细胞主要通过细胞因子白介素-10(interleukin-10,IL-10)和转化生长因子-β 在机体免疫系统中发挥负向调节作用，既能抑制不恰当免疫反应,又能限定免疫应答的范围、程度及作用时间,从而维持免疫稳态[7]。叉头翼状螺旋核转录因子3(Forkhead/winged helix nuclear transcription factor 3,Foxp3)高表达于CD4+CD25+Treg 细胞，是Treg的特征性标志,亦是其特异性转录因子。而Th17 细胞主要通过分泌促炎细胞因子来介导自身免疫的发生发展，由于高水平分泌白介素-17(Interleukin-17,IL-17)而被命名为Th17 细胞，维甲酸受体相关孤儿受体γt(Retinoic receptor-related orphan receptor γt,RORγt)是其特异性转录因子[8]。现已观察到在多种自身免疫性肾病中都广泛存在着Treg/Th17细胞轴平衡失调[9-13]。随病情加重，Treg/Th17 细胞轴失衡也更加明显。但目前尚不清楚该细胞轴与成人HSPN 的发病是否相关。本研究通过分析成人HSPN患者外周血Treg/Th17细胞轴的表达，进一步研究该病的发病机制，同时探讨该细胞轴失衡与中医证型之间的相关性，为临证运用中医药辨证论治提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象

研究组43例成人HSPN患者来自湖北省中医院肾病科门诊（过敏性紫癜性肾炎队列研究JDZX2015194），其中男性19 例，女性24 例，年龄20-65 岁，平均年龄（37.33±10.47）岁；平均病程（55.65±37.54）月。对照组为13 名健康受试者，其中男性6 名，女性7 名，年龄26-56岁，平均年龄（32.85±9.45）岁。两组研究对象性别、年龄的比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究得到湖北省中医院伦理委员会批准并取得所有受试者的知情同意（伦理批件号：HBZY2019-C37-01）。

1.1.1 研究组（HSPN受试者）诊断标准

西医诊断标准：2011 年中华医学会主编《临床诊疗指南-肾脏病学分册》（人民卫生出版社）HSPN 诊断标准。

中医病名及中医本证证型诊断标准：参照2019年1 月由中华中医药学会发布，湖北省中医院牵头修订的中医临床诊疗指南中紫癜肾（过敏性紫癜肾炎）中病名及中医本证证型诊断。

1.1.2 研究组（HSPN受试者）纳入及排除标准

纳入标准：①年龄18-60岁；②符合上述诊断标准的患者；③经肾脏病饮食改良(modification of diet in renal disease,MDRD)公式计算的肾小球滤过率＞60 mL·（min·1.73m2）-1；④24 h 尿蛋白定量≤3.0 g；⑤提供知情同意并配合完成研究所需要的流程。

排除标准：①妊娠期或哺乳期妇女；②正在参与干预性临床实验的患者；③既往3 个月内或正在因HSPN 接受皮质激素及免疫抑制剂治疗者；④1 型或2型糖尿病患者；⑤美国纽约心脏病学会心功能分级Ⅲ级或Ⅳ级心力衰竭患者，即有基础心脏疾病，体力活动明显受限，小于一般体力活动甚至休息状态下即可出现疲乏、心悸、气喘或心绞痛症状的患者；⑥病毒性肝炎或肝硬化患者；⑦艾滋病毒感染患者；⑧恶性肿瘤患者；⑨既往接受超过1个月的透析治疗，和（或）器官或骨髓移植患者；⑩既往诊断为多囊肾等遗传性肾脏疾病患者。

1.1.3 对照组（健康受试者）纳入及排除标准

纳入标准：①年龄18-60 岁；②血、尿、粪便常规，肝肾功能，血脂等项目在体检报告中属于正常范围；③提供知情同意。

排除标准：①既往有高血压、糖尿病、冠心病、高尿酸血症或高脂血症等慢性病病史者；②既往有遗传病病史者；③既往有支气管哮喘、皮肌炎、湿疹、甲状腺炎、溃疡性结肠炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、肾小球肾炎等自身免疫、过敏性疾病病史者；④恶性肿瘤患者；⑤合并急性感染者；⑥合并病毒性肝炎、尖锐湿疣等慢性感染性疾病者。

1.2 主要试剂和仪器

PerCP Mouse Anti-Human CD4(SK3)（货号347324）、FITC Mouse Anti-Human CD25（货号555431）、PE Mouse anti-Human Foxp3（货 号 560852）、Human Th1/Th2/Th17 phenotyping Kit（货号 560751）、破膜剂 FACS Permeabilizing Satution2（货号340973）、红细胞裂解液FACSTM Lysing Solution (10X)（ 货 号 349202）、BD GolgiStop™Protein Transport Inhibitor（货号51-2092KZ）均购自美国 BD 公司；TRIzol 液购自 Ambion 公司(货号15596026)；cDNA 第一链合成试剂盒购自 TAKARA 公司(货号 639505)；SYBR Green PCR 试剂盒购自 KAPA Biosystems 公司(货号 KM4101)；DNase I 生产厂家为立陶宛Fermentas 公司（货号AM2295）；聚合酶链反应引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成；IL-17、IL-10 酶联免疫吸附试验试剂盒购自Bioswamp 公司（IL-17 货号 HM10198，IL-10 货号 HM10203）。FACS Calibur 流式细胞仪购自美国BD 公司；荧光定量聚合酶链扩增仪(仪器型号CFX-Connect96)购自美国Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 检测Treg细胞

采用流式细胞术测定CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+百分率。取两只试管，分别标记为样本检测管及阴性对照管。分离受试者外周血单个核细胞，按照标准操作调整细胞悬液浓度。向试管中加入4℃Anti-CD4-PerCP 及Anti-CD25-FITC 单克隆抗体，常温避光孵育20 min。再加入红细胞裂解液2 mL，混匀后室温避光孵育10 min。固定重悬细胞后加入破膜剂常温避光孵育10 min，加入Anti-Foxp3-PE，室温避光孵育20 min，洗涤重悬处理后上机检测。通过Cellquest 软件进行收集分析数据。

1.3.2 检测Thl7细胞

采用流式细胞术测定CD4+IL-17A+细胞/CD4+细胞百分率。取两只试管，分别标记为样本检测管及阴性对照管。分离受试者外周血单个核细胞，调整细胞悬液浓度，按照标准操作浓度加入BD GolgiStop™蛋白转运抑制剂刺激细胞之后，混匀放置细胞培养箱中培养5 h。固定破膜处理后向试管中加入4℃Human Th1/Th2/Th17 phenotyping Kit 中 的 CD4-PerCP-Cy5.5 与IL-17A-PE 抗体，室温避光孵育30 min 后洗涤、重悬上机检测。通过Cellquest软件进行收集分析数据。

1.3.3 检测Foxp3 mRNA、RORγt mRNA

采用实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法测定。106个细胞的离心管中加入 TRIzol 液 1.0 mL 提取总 RNA，利用 TAKARA 试剂盒进行cDNA 第一链合成，严格按照试剂盒说明书进行操作。Primer Premier 5.0 软件参照GenBank cDNA 序列设计 Foxp3、RORγt 及 βActin 引物，具体序列如下：Foxp3 5’-ACCAAGGCTTCATCTGTG-3’，5’-CTCTGGGAATGTGCTGTT-3’，产物大小 216 bp；RORγt 5’ -TCCACTACGGGGTTATC-3’ ， 5’ -TGTCCCTCTGCTTCTTG-3’，产物大小 171 bp；内参βActin 5’ -ACACTGTGCCCATCTACG-3’ ， 5’ -TGTCACGCACGATTTCC-3’，产物大小153 bp。采用SYBR Green PCR 试剂盒进行实时PCR 扩增上下游引物各 5 μmol，反应体系为 20 μL：SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 8μL。反应程序：95℃，3 min；95℃，5 s；56℃，10 s；72℃，25 s；39 个循环；65℃，5 s；95℃，50 s。扩增结束后采用仪器自带软件qbase plus进行数据分析。

1.3.4 检测IL-17、IL-10

采 用 酶 联 免 疫 吸 附 法 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定。予 IL-17、IL-10 酶联免疫吸附试验试剂盒检测IL-17、IL-10 浓度。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 样本量计算

根据第七版《流行病学》（王建华，2008，人民卫生出版社）两样本均数比较的样本含量估计计算公式。参照儿童紫癜性肾炎相关文献[8]，过敏性紫癜肾炎患儿血清Treg 细胞阳性率为(3.1±1.1)%，正常儿童血清Treg 细胞阳性率为(4.9±1.4)%。两组合并标准差为1.25。设α=0.05（双侧）、β=0.1；查表得f（0.05，0.1）=10.5。将各数值带入公式计算后得出n=10。考虑研究组涉及与三种中医证型的相关性研究，预估样本量不少于30例；对照组样本量不少于10例。

1.5 统计学方法

应用SPSS 23.0 软件进行数据分析。呈正态分布的计量资料用(-)表示，计数资料用百分比表示。用科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫检验（Kolmogorov-Smirnov test）判断计量资料是否呈正态分布。符合正态分布的两组计量资料间的比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用方差分析。P<0.05为有显著差异。

2 结果

2.1 成人HSPN患者外周血Treg及Th17的表达水平

流式细胞术检测结果显示研究组及对照组受试者外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+百分率分别为(4.29±1.50)%和(6.44±2.90)%，提示成人HSPN 患者外周血Treg 表达水平较健康受试者下降(P<0.05（)图1，表1）。研究组及对照组受试者外周血CD4+IL-17A+/CD4+百分率分别为(4.03±1.67)%和(2.65±1.55)%，提示成人HSPN 患者外周血Th17 表达水平较健康受试者升高(P<0.05（)图2，表1）。

2.2 成人 HSPN 患者外周血 Foxp3 及 RORγt mRNA 的表达水平

实时定量PCR 检测结果显示研究组及对照组受试者外周血 Foxp3/βActin 分别为 1.26±0.04 和 1.29±0.05，提示成人HSPN 患者外周血Foxp3 mRNA 表达水平较健康受试者下降(P<0.05)。研究组及对照组受试者 外 周 血 RORγt/βActin 分 别 为 1.30±0.05 和 1.27±0.03，提示成人 HSPN 患者外周血 RORγt mRNA 表达水平较健康受试者升高(P<0.05)(表1)。

图1 健康受试者/HSPN患者外周血Treg表达

图2 健康受试者/HSPN患者外周血Th17表达

表1 成人HSPN外周血Treg与Th17、Foxp3与RORγt mRNA、IL-10与IL-17表达结果比较

2.3 成人HSPN患者血清IL-10及IL-17的浓度

ELISA 检测结果显示研究组及对照组受试者血清IL-10 的浓度分别为（106.57±9.47）pg/mL 和（174.21±32.18）pg/mL，提示成人 HSPN 患者血清 IL-10 水平较健康受试者明显下降(P<0.01)。研究组及对照组受试者血清 IL-17 的浓度分别为（362.13±67.53）pg/mL 和（167.09±24.97）pg/mL。提示成人HSPN 患者血清IL-17水平较健康受试者显著升高(P<0.01)(表1)。

2.4 成人HSPN患者中医证型分布情况

本研究中气阴两虚证患者23 例，其中男性11 例，女性 12 例，平均年龄（36.22±12.73）岁，平均病程（49.48±21.81）月；脾肾气虚证患者12 例，其中男性4例，女性 8 例，平均年龄（38.33±7.33）岁，平均病程（43.00±18.01）月；肝肾阴虚火旺证患者8例，其中男性4 例，女性 4 例，平均年龄（39.00±7.45）岁，平均病程（92.38±67.15）月。各组在年龄、性别、病程方面差别无统计学意义(P>0.05)(表2)。

2.5 不同中医证型的成人HSPN 患者外周血相关免疫指标表达结果

成人HSPN 气阴两虚证患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+百分率(3.64±1.25)较脾肾气虚证患者(5.29±1.47)显著降低(P<0.01)。气阴两虚证患者IL-10 浓度[(103.37±9.40)pg·mL-1]较 脾 肾 气 虚 证 患 者 [(112.86±8.29)pg·mL-1]显著降低(P<0.01)。肝肾阴虚火旺证患者 IL-17 浓度[(419.34±61.73)pg·mL-1]较气阴两虚证患者[(358.99±70.09)pg·mL-1]升高(P<0.05)。肝肾阴虚火旺证患者IL-17 浓度[(419.34±61.73)pg·mL-1]较脾肾气虚 证 患 者 [(330.02±40.46)pg·mL-1]显 著 升 高 (P<0.01)(表 3)。

3 讨论

在本研究中，研究结果表明成人HSPN 患者外周血Treg 细胞百分率与Treg 特异性转录因子Foxp3 mRNA 及其有效细胞因子IL-10 的表达水平明显下降，低于健康受试者。而Th17 细胞百分率与Th17 特异性转录因子RORγt mRNA 及其分泌的细胞因子IL-17的表达水平显著增加，高于健康受试者。从而证实成人HSPN患者存在Treg/Th17细胞轴免疫失衡。Treg细胞抑制炎症反应并维持免疫稳态而Th17 细胞引起自身免疫和炎症。其中IL-10发挥抑制局部炎症反应作用同时也是Treg 体内外主要诱导增殖和促生长的细胞因子[14]；而前炎性细胞因子IL-17 则具有强大的促炎作用，能生产多种促炎趋化和细胞因子诱发自身免疫和炎症[15]。CD4T细胞亚群并非固定不变，当受到不同细胞因子刺激时，它们可以转化为其他亚型。HSPN 在一系列免疫炎症反应中发生，促炎环境又进一步导致Th17 细胞分化过多，恶性循环导致疾病不断发展，病情反复。以上结论与既往紫癜性肾炎患儿的相关研究结果相符[16-17]。所以机体维持Treg/Th17 细胞轴的平衡至关重要，在很大程度上将会避免自身免疫和炎症反应发生。因此纠正HSPN 患者Treg/Th17 细胞轴失衡可以作为治疗该病的策略及研究方向。

表2 成人HSPN患者中医证型分布情况比较

表3 不同中医证型的成人HSPN患者外周血相关免疫指标表达结果比较

古代中医典籍中并无“过敏性紫癜肾炎”的病名，近代中医多将其归属于“葡萄疫”“紫斑”“尿血”等范畴。2010 年国家中医药管理局重点专科优势病种肾病协作组根据该病血尿、蛋白尿、皮疹、紫癜等临床表现，将其命名为“紫癜肾”[18]。结合临床急性发作与迁延反复的特点，常把该病分为急性期与慢性（迁延）期两个阶段来辨证论治。患者急性期多因风热、毒邪致病，热毒入血，燔炽营血，扰动肾络，迫血妄行，血液不循常道溢于脉外肆虐发为紫斑、血尿。急性期过后实邪入里进入迁延期，火热熏灼，热毒耗伤阴血，虚火内生，迫血妄行；壮火极易食气，气虚不能摄血，血溢脉外；离经之血留积肾络，蓄结为瘀。该病总体病理性质当属气血阴阳失调，虚实夹杂。虚证乃气虚与阴虚共存；实证乃瘀血与热毒互结，共同构成该病发生发展的病理基础。目前，多种免疫性疾病Treg/Th17细胞轴失衡与中医病证之间的相关性研究是近年来的研究热点之一，但关于HSPN 的研究报道甚少。在慢性免疫性血小板减少症的研究中发现，在本虚方面，Treg计数在气虚患者中最低，其次为阴虚患者[19]。在类风湿关节炎患者不同中医证型外周血Th17/Treg 细胞表达特点的研究中发现该病以痰、湿为基本病理因素，临证有寒化、热化、兼瘀等证候变化，其中，兼热、兼瘀的患者其Th17 细胞均为高表达[20]。此外，在乙肝相关性慢加急性肝衰竭的研究中，瘀热患者多处于疾病的初期及中期，此时机体处于免疫炎症反应亢进状态，Th17 细胞及相关因子IL-17A 升高明显，随着病程进展至末期，正气亏虚明显，Treg 细胞特异性转录因子Foxp3 mRNA 表达逐渐下降[21]。结合“紫癜肾”该病发生发展的病理基础及Treg/Th17 细胞轴失衡的研究结论，考虑成人HSPN 患者Treg 细胞轴表达下降可能与机体气虚及阴虚密切相关，而Th17细胞轴表达上升可能与体内瘀热偏亢相关。与上述既往研究中免疫炎症性疾病不同病理因素与相应免疫指标的变化趋势相似[19-21]。

本研究发现，在成人HSPN 慢性（迁延）期中医本证证型中以气阴两虚证最为多见，其次为脾肾气虚证及肝肾阴虚火旺证。肺气虚卫外功能下降易感受外邪发病，脾气虚不能统摄，血溢脉外，肾气虚不能封藏，精微下注，发为血尿、蛋白尿；阴虚火旺迫血妄行，外渗于肌肤见紫斑，内走脏腑脉络见血尿。气阴两虚证患者临床常表现为皮肤紫癜反复，易感冒，血尿，蛋白尿，腰酸乏力，口干咽干等症状，与肺、脾、肾三脏虚损有很大关系。脾肾气虚证患者以蛋白尿血尿并见，倦怠乏力，气短懒言，口淡不渴，食少腹胀，下肢轻度水肿为常见症状，主要累及脾、肾两脏。肝肾阴虚火旺证患者以头晕耳鸣，目干涩痛，手足心热，盗汗，大便干燥，腰膝酸软为主要表现，累及肝、肾两脏。随病情进展终致阴阳俱虚，脾阳亏虚水湿不得运化，中焦升降失调，肾阳虚衰化气行水失功，下焦开阖无权，水湿停聚外渗肌肤，临证出现面浮肢肿、尿少，脾肾衰败后湿浊毒邪内聚弥漫三焦，小便不通与纳差呕恶并见，发为“慢性肾衰竭”“关格”重症。本研究纳入的HSPN患者肾小球滤过率均大于60 mL·(min·1.73m2)-1，随着肾功能进一步下降，阴损及阳，阴阳俱虚，当属“慢性肾衰病”的范畴，本研究暂不讨论。

此外，研究结果提示HSPN 气阴两虚证型患者外周血Treg及IL-10的表达水平较其他中医证型下降明显。结合Treg和IL-10能够抑制不恰当免疫反应的特点，不防推测临床运用益气养阴方药能够升高HSPN患者外周血Treg 和IL-10 的表达水平,恢复自身免疫调节能力，抑制不恰当的免疫反应发生。而HSPN 肝肾阴虚火旺证型患者外周血IL-17浓度升高较其他证型明显。由于IL-17 是强效促炎细胞因子，阴虚火旺日久内热与瘀血互结，故而运用滋阴降火、清热凉血方药则能够降低IL-17 的表达水平，在一定程度上抑制免疫炎症的发生发展。在整个过程中，机体Treg/Th17 细胞轴失衡与气血阴阳失调变化密切相关。因此，在调节气血阴阳治则的指导下，灵活应用益气养阴、清热凉血等具体治法调节免疫，纠正Treg/Th17 细胞轴失衡不失为一条治疗HSPN 的新思路，为下一步研究中医药治疗该病提供理论基础。