药用植物质量性状的分子研究进展＊

詹海仙，杜晨晖，李 睿，尚彩玲，张 瑜，胡 楠，裴香萍

（山西中医药大学中药与食品工程学院 晋中 030619）

药用植物是指全部或部分植株可以直接入药或作为药物生产的植物。我国药用植物资源丰富，其应用已有几千年历史。尤其是来源于特定产区的道地药材，由于具有药用成分含量高、临床效果好的优点，属于我国的一种特色的传统药物[1]。造成药用植物道地性与非道地性差异的主要原因包括种质资源、生长环境及气候条件三个因素[2]，其中优良的种质资源是道地药材优良品质形成的内在因素，由于特定的基因调控植物次生代谢产物等有效成分的产生，因此，种质资源包含的特定基因是药材道地性形成的关键。由于大多数药用植物为虫媒异花授粉植物，栽培过程中易混杂，容易导致品种退化，进而造成品质和产量下降。因而研究种质资源道地性形成的内在机制和导致道地性形成的特定基因，是提高药材品质和选育优良品种的基础。

随着分子生物学技术的不断发展，药用植物道地性相关质量性状研究、分子遗传图谱构建及重要性状基因的定位、克隆和转化方面取得了较大的进展，也为优良性状的定向培育提供了有效的指导工具。本文综述了目前药用植物道地性研究现状、标记开发、遗传图谱构建、相关性状数量性状位点（QTL）定位、转录组测序、基因工程等技术对药用植物相关性状基因的挖掘现状，以期为提高药用植物种质资源的道地性研究提供参考。

1 药用植物道地性研究进展

药材品质关系到临床用药的有效性，而道地药材是药材品质的关键所在。道地药材在其道地产区往往种植面积大，栽培管理规范，药用成分含量高，因此，可获得较大的经济效益。黄璐琦院士的道地药材形成的模式假说认为种质资源、生长环境及气候条件是造成道地药材与非道地药材品质差异的主要原因[3]。国内外涉及药用植物道地性相关的质量性状的研究技术主要集中在下面几个方面，利用高效液相色谱（HPLC）对道地和非道地的唇形科植物丹参中3 种药用成分的含量进行了比较分析，证实道地产区的丹参中药用成分含量远高于非道地产区[4]。通过对毛茛科植物白芍进行HPLC 分析，建立了白芍道地性化学特征指纹图谱，该指纹图谱可用于白芍道地性和药材质量评价[5]。利用HPLC 比较了不同基源和产地的桔梗科植物党参的特征图谱，并建立了山西道地药材潞党参的HPLC 特征图谱[6]。HPLC 还建立了三白草科植物鱼腥草、毛茛科植物附子和白芍以及五加科植物人参等药用植物的特征指纹图谱，为研究上述植物的道地性提供了一系列参考数据。

采用近红外光谱技术可以快速区分道地产区与非道地产区的广陈皮和当归[7]。利用电子鼻传感器的响应值作为指标对菊科植物白术和白菊、木犀科植物茉莉、蔷薇科植物金樱子气味指纹变化进行分析[8-9]。分子标记技术在道地性药材鉴定和分析上发挥了较大的作用，采用随机扩增多态DNA（RAPD）标记结合HPLC 技术研究了3 个不同产地的山西道地药材连翘的道地性[10]。将RAPD 标记与SCAR 标记结合，对罗汉果性别进行早期鉴定[11]。DNA 条形码技术是从基因水平区分道地中药材，近年来在中药真伪品鉴别上的应用很多，将DNA 条形码与ISSR 分子标记相结合鉴别不同产区的唇形科植物广藿香[12]。通过DNA 条形码技术可以准确区分紫丹参、冬虫夏草和雪胆及其伪品[13]。但是，由于道地性为微效多基因控制的数量性状，与单基因控制的质量性状相比，数量性状遗传基础复杂，常规方法难以对道地性相关的基因数目、位置、效应及作用方式进行分析[3]。随着现代分子生药学和测序技术的发展，数量遗传学的方法，尤其是以分子遗传连锁图谱和标记开发为基础的标记-QTL 连锁分析的方法成为揭示药用植物道地性分子机理的重要手段。

2 药用植物标记开发及遗传图谱构建

高密度的遗传图谱及QTL 定位研究有助于挖掘控制复杂性状的重要性状基因，分析相关性状的遗传机制。多态性的分子标记是构建遗传图谱并进行相关性状QTL 分析的基础。这些标记的开发为了解药用植物的遗传多样性、种间遗传分化和栽培育种提供分子生物学依据。简单重复序列（SSR）、简单序列重复区间扩增多态性（ISSR）、随机扩增多态性（RAPD）、相关序列扩增多态性（SRAP、）靶位区域扩增多态性（TRAP）和扩增片段长度多态性（AFLP）等标记曾经是构建药用植物遗传图谱的主要方法，构建了茄科植物甘薯、兰科植物石斛、唇形科植物丹参、杜仲科植物杜仲、龙胆科植物龙胆、旋花科植物甘薯、十字花科植物萝卜和光茸菌科植物香菇等药用植物的遗传图谱。但是，由于这些标记在基因组中的丰富性较差，可用的标记数量少，构建的遗传图谱密度和饱和度均不高。

近年来，随着测序技术迅猛发展，构建遗传图谱的分子标记不断丰富，尤其是单核苷酸多态性（SNP）标记的大量发掘利用，极大的提高了植物遗传图谱的密度和饱和度[14]。SNP 标记具有多态性好、密度高、数量丰富且覆盖全基因组的优点。基于测序技术开发相关标记，同时针对特异位点设计多种标记，结合多种标记技术为构建植物高密度遗传连锁图谱提供了技术保障，这些标记已用于药用植物连锁图谱的构建。目前，基于高通量技术的基因芯片技术、重测序（BSA）技术、混池转录组测序（RNA-seq）技术和简化基因组测序（SLAF-seq，GBS）技术在药用植物遗传图谱构建和相关性状基因定位方面展现了较大作用。基因芯片技术构建了蔷薇科植物桃的遗传图谱，简化基因组测序技术（RAD）开发出莲科植物栽培荷花、蔷薇科植物山楂和玫瑰的高密度遗传图谱[15]。测序基因分型（GBS）和竞争性等位基因特异性PCR（KASP）分型技术结合获得蔷薇科植物杏和芍药科植物牡丹的连锁图谱[16]。SLAF-seq 技术是通过限制性内切酶消化基因组DNA，降低了基因组的复杂度，且不依赖参考基因组序列，具有快速、准确鉴别标记优点。利用SLAF-seq技术分别构建了唇形科植物丹参、木犀科植物银杏和桂花、芍药科植物牡丹、兰科植物铁皮石斛、杨柳科植物旱柳、蔷薇科植物梅花和豆科植物小豆的高密度遗传图谱[17-21]。多数遗传图谱均为该植物的首张遗传图谱，其中，梅花的高密度遗传图谱，连锁图上包含8 007 对引物，为梅花数量性状基因定位和分子育种提供参考[21]。山东农业大学构建的丹参高密度遗传图谱，包含有8 个连锁群，覆盖率高达99.83%，为丹参农艺性状基因的研究提供了重要信息[22]。牡丹的高密度遗传图谱全长920.699 cM，5 个连锁群上引物间的距离仅有0.774 cM[23]。

上述遗传图谱为药用植物道地性相关性状基因鉴定和分析提供了重要遗传信息（部分药物的遗传图谱统计见表1）。同时，发出的大量分子标记可为药用植物道地性相关基因定位和克隆工作奠定了基础。

表1 部分药用植物的遗传图谱统计

3 药用植物相关性状QTL定位研究

高密度遗传图谱构建和分子标记开发有助于对植物相关数量性状QTL 定位研究。随着药用植物连锁图谱的不断构建，大量药用植物物相关性状QTL 定位分析也得到了发展。蔷薇科植物梅花的垂枝等15个重要性状QTL 分析及候选基因的挖掘，将垂枝性状定位到第7 号染色体，挖掘出预测参与基因转录调控的基因[21]。菊科植物菊花耐涝性相关的37 个非条件QTL 和51个条件QTL 位点分析，对于指导菊花耐涝性品种的分子选育工作具有重要意义[29]。蔷薇科植物杏的壳硬度相关基因也进行了QTL 定位分析。玫瑰的花色 QTL 位点被定位到第 1、2、6 和 7 号染色体[30]。通过QTL 分析识别出与山楂黄酮类化合物含量相关的21 个QTL 位点，解释16.30%-59.00%的变异[25]。豆科植物小豆开花时间相关的主效QTLs 位点和2 个微效QTLs 位点被识别[27]。筛选出与大豆总异黄酮含量相关的15 个QTL 位点50%[31]。18 个影响杜仲科植物杜仲生长相关性状的QTL 位点被识别，对表型变异的解释率为12.4%-33.3%，该遗传连锁图谱为杜仲基因组标记辅助选择和基因组研究提供了工具[32]。1 个与十字花科植物萝卜根部镉累积有关的主效QTL qRCd9被定位到第9 号染色体上，LOD 值为23.6[33]。上述药用植物以遗传图谱为基础并进行了相关性状QTL 定位，对于进一步解析这些性状的遗传机制奠定了基础。

4 转录组测序技术对药用植物相关性状基因的挖掘现状

转录组测序分析可以批量挖掘物种功能基因，比较基因在不同样品中的表达差异，为药用植物功能基因的挖掘和次生代谢成分的生物合成途径探索提供了新方法。目前，千种植物转录组计划已完成1 000余种植物的转录组数据测序、归档和分析研究工作[34]。药用植物包括唇形科植物丹参、菊科植物青蒿和灯盏花、三白草科植物鱼腥草、五加科植物三七和人参、百合科植物七叶一枝花、豆科植物甘草及沙冬青、天南星科植物魔芋、玄参科植物地黄、兰科植物铁皮石斛、芍药科植物牡丹、红豆杉科植物红豆杉、麻黄科植物麻黄、粟科植物博落回、茄科植物枸杞、夹竹桃科植物长春花、葫芦科植物罗汉果、龙胆科植物龙胆、多孔菌科植物灵芝、木犀科植物连翘和桔梗科植物党参等[35-40]。

通过转录组数据开发出海量的分子标记，为药用植物道地性分析、遗传图谱构建等研究提供了参考。大量的药用植物分子标记被开发，包括五加科植物刺五加、桑科植物桑葚、茄科植物黑果枸杞、杜仲科植物杜仲、唇形科植物夏枯草、毛茛科植物黄连、爵床科植物穿心连、百合科植物川贝母、兰科植物金钗石斛、胡颓子科植物沙棘、无患子科植物文冠果、伞形科植物川芎、木犀科植物连翘以及豆科植物苦参、膜荚黄芪、蒙古黄芪、槐叶决明和中间锦鸡儿等。涉及利用转录组数据开发出厚朴的SSR 和EST-SSR 标记，为厚朴的资源保护等研究提供了大量数据[41]。以转录组数据为基础，开发出红花EST-SSR 标记经不同种质红花验证，获得多态性扩增条的引物可达40%以上[42]。肖亮等[43]通过对葛根转录组测序数据分析，设计开发出28对多态性引物，这些引物可用于不同葛根资源的遗传多样性分析。从三七转录组测序数据中确定了2 772个SSR，这些标记的开发为三七的分子标记辅助育种提供了参考数据[44]。

通过转录组测序挖掘出一些药用植物活性成分合成的功能基因及相关的代谢通路，丹参转录组分析主要涉及丹参酮合成基因，党参主要涉及党参多糖合成相关基因，人参涉及皂苷生物合成途径的酶和糖基转移酶的基因，银杏涉及黄酮类生物合成的基因，三七涉及皂甙生物合成途径中相关的候选基因，连翘转录组分析主要涉及金丝桃素生物合成的基因，灯盏花测序主要涉及灯盏乙素合成的候选基因，罗汉果转录组测序涉及甜甙生物合成的候选基因，甘草涉及甘草酸合成的关键酶基因[46-50]。西洋参涉及所有与人参皂苷合成相关的酶基因，西藏延龄草涉及甾体皂苷生物合成等代谢过程中的基因，蒙古黄芪涉及异丙氨酸和三萜皂苷生物合成相关的基因，丹参涉及丹参素生物合成早期的编码酶基因[50-53]。

5 药用植物基因工程研究现状

药用植物的道地性体现在其次生代谢产物的含量及产量上，而人工栽培药用植物普遍存在有效成分含量减少和品种退化等问题。随着1983 年世界首例转基因植物培育成功，基因工程技术近年来在农作物领域取得较大进展并逐步推广，已克隆了不同来源的抗病、抗虫、抗逆和抗除草剂的基因并进行转化应用，减少了农药和除草剂的使用及残留，提高了农作物抗病性、抗逆性及产量。将上述基因转入药用植物，通过基因工程手段提高其次生代谢产物含量和病虫害抗病能力，从而进一步提升药材产量和品质。目前主要通过农杆菌介导的方式将一些抗性和荧光蛋白等模式基因导入蒿、石刁柏、枸杞、地黄、甘草、黄芩等药用植物，且已获得转基因植株[54-55]。除草剂抗性基因转入颠茄中，提高了颠茄和四倍体菘蓝对除草剂的抗性[56-57]。四倍体菘蓝和枸杞中分别转入来自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白基因、豇豆胰蛋白酶抑制剂基因和雪花莲凝集素酶基因，转基因植株分别具有对小菜蛾和蚜虫抗虫能力[58]。将抗微生物活性的抗菌肽分别导入阳春砂和鱼腥草受体植株，获得了抗菌活性强的转基因植株[59-60]。将水稻的几丁质酶基因和苜蓿的相关基因转入白术植株，获得了抗白术立枯病的阳性转化植株[61]。在已知合成代谢途径的情况下，还可通过基因工程的手段直接提高药用植物次生代谢产物的含量。尤其是对于药用成分含量比较低，常规育种已无法满足生产需要的药用植物，将反义鲨烯合酶基因转入青蒿植株中，获得的阳性转化植株中青蒿素的含量得到较大的提高[62]。

转基因植物需要进行安全评价和环境安全性评价，食用安全性评价包括毒理学评价和致敏性评价两部分，与农作物长期食用不同，中药仅在治疗阶段才需要食用，且中药在食用前已经过炮制、煎煮等工艺处理，食用安全性方面相对比较可靠。环境安全性评价包括生存竞争能力评价、基因漂移环境影响评价、生物多样性影响评价、靶标害虫抗性风险评价。药用植物种植面积较小，环境安全性方面更容易控制[55]。总之，不论农作物还是药用植物，均需经过严格的食用性评价、环境安全性评价以及一系列安全评价审批程序才可获得应用安全证书。

6 展望

药用植物道地性提高的关键是适宜的生长环境、气候条件及药用成分含量高的种质资源，其遗传机制属于多基因作用下的数量性状，是典型的连续性变异，主要表现在植物形态、生理机能和次生代谢产物上的特化。当前，对道地性形成的遗传机制了解不足，成为制约药用品质提高和品种选育的瓶颈之一。随着现代分子生药学和分子育种的快速发展及应用，挖掘与道地性直接相关的基因是道地性药材基因工程研究和品种选育基础。因此，在道地产区不变的基础上，可利用现代分子生物学技术，尤其是高通量测序解析道地性形成的内在遗传机制，明确道地性形成的数量性状位点，定位、克隆相关基因并导入受体植株中。同时，除明确药用植物本身的基因数量、位置、结构及其功能外，还应关注生长环境和气候条件等外在因素变化对道地性的影响，了解环境因子与基因之间的互作关系，从而利用分子生物学手段可显著提高道地药材的药用品质。