酒黄连HPLC特征图谱的建立及聚类分析和主成分分析＊

康念欣，袁炎炎，张 潇，路颖慧，李晴霞，李 飞，谭 鹏

（北京中医药大学中药学院 北京市科委 中药生产过程控制与质量评价北京市重点实验室 北京 102400）

黄连为毛茛科植物黄连（Coptis chinensisfranch）、三角叶黄连（Coptis deltoideaC. Y. cheng et Hsiao）、云连（Coptis teetawall.）的干燥根茎，味苦、性寒，归心、肝、胃、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的作用[1]。黄连中主要含非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、小檗碱、巴马汀等生物碱类成分[2]，还含有阿魏酸、绿原酸、黄柏酮、槲皮素和微量元素等非生物碱类成分[3]。

黄连的炮制首次记载于南朝刘宋时期雷敩所著的《雷公炮炙论》，有“凡使黄连，以布拭上肉毛，然后用浆水［炊粟米熟，投冷水中，浸五、六日，味酢（酸味），生白花，色类浆，故名浆水］浸二伏时，漉出，于柳火中焙干用”的记载。黄连的炮制品有生黄连、酒制黄连、姜制黄连、吴茱萸制黄连等，采用不同的辅料炮制可改变黄连的性味，从而改变其功效，如黄连经酒制后可引药上行，缓和寒性，清头目之火；经姜制可缓和黄连过于苦寒之性，止呕作用增强；吴茱萸制黄连可抑制黄连苦寒之性，使其寒而不滞，清气分湿热[4]。

目前，对于黄连及其炮制品质量鉴别的方法学研究以指纹图谱的研究较多,且集中于黄连不同炮制品指纹图谱及炮制前后化学成分含量差异、变化研究。性状量化鉴别方法主要包括电子舌[5]、电子鼻[6]等，化学成分及指纹图谱的研究多使用高效液相色谱（HPLC）[7]、超高效液相色谱—三重四级杆串联质谱（UPLC-MS/MS）[8]等方法。廖庆文等[9]采用 HPLC 法，研究了黄连不同炮制品的炮制机理，建立黄连六种炮制品的HPLC 图谱，采用指纹图谱相似度分析和聚类方法分析其结果，可将六种黄连炮制品分为两类，表明其分类结果与药性相关，符合传统中医药理论中的“丛制”“反制”理论；有研究采用3 批黄连药材建立了黄连片、酒黄连、姜黄连、萸黄连四种饮片的特征图谱，测定了小檗碱、木兰碱、巴马汀、黄连碱、药根碱等5 种化学成分的含量，结果显示黄连不同炮制品间色谱峰数量和峰面积均有差异，黄连炮制前后化学成分含量发生有规律变化[10]；已有研究建立黄连片、萸黄连和姜黄连各十批饮片的指纹图谱和红外图谱，对三种饮片的指纹图谱进行聚类分析，对红外图谱进行主成分分析，三者的指纹图谱和红外图谱相似度差异较小，分别经聚类分析、主成分分析后，可将三种饮片区分开[11]。关于结合聚类分析和主成分分析方法分析酒黄连特征图谱的研究鲜有发现。

目前，药品标准中黄连炮制品与黄连饮片的质量标准基本相同，使得质量控制标准模糊[12]。酒黄连为黄连的炮制品之一，在《中华人民共和国药典》2015 年版及全国各地炮制规范中其炮制方法均为酒炙，并且《中华人民共和国药典》中无酒黄连炮制工艺的具体工艺参数；各地方炮制规范中酒黄连辅料用量，炮制程度等存在差异，导致饮片质量不稳定。

聚类分析是将随机现象归类的统计学方法，即根据已知数据，计算变量与个体之间的距离或相关系数等统计量来表明不同个体与变量之间的相关性，并根据“最短距离法”“最长距离法”等法则使得同类个体差别较小，不同类个体差别较大，从而将原始数据划分为不同的类别，类别的数目和其组成未知。主成分分析是一个正交化线性变换的过程，通过线性变换，将原始数据中多个相关指标组合成几个综合指标（主成分），即原始指标的线性组合，综合指标可保留原始指标的主要信息，但互不相关，即主成分可代表原始数据，简化分析模型。将主成分分析和聚类分析相结合的分析方法已经用于工业生产、空气质量评价和农业等方面[13-15]，并且已应用于中药材和中药饮片质量评价。王悦云等[16]建立了不同产地的34 批粗毛淫羊藿的指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析和因子分析评价各产地粗毛淫羊藿质量，选出其质量较好的产地为贵阳、凯里、麻江等地。有研究[17]结合聚类分析和主成分分析研究檀香13 批药材的指纹图谱，挥发油含量较低的S3、S4 批次的檀香归为一类，其他批次药材归为一类，表明该方法可合理地评价檀香药材质量。还有研究采用主成分分析和聚类分析方法对青皮[18]、尖尾风[19]等饮片质量进行评价。

本研究以前期实验中优选的最佳炮制工艺（取净黄连，加黄酒（黄酒进行稀释1∶4）闷润2 h，至液吸尽，(150±10)℃炒制20 min，每100 kg黄连，用黄酒12.5 kg）炮制不同批次黄连所得到的酒黄连、中试所得酒黄连以及收集得来的酒黄连为研究对象，应用HPLC 法建立酒黄连的特征图谱，并在酒黄连的特征图谱研究中运用聚类分析、主成分分析等方法结合处理实验数据，对酒黄连质量进行评价，以期为酒黄连的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695 高效液相色谱仪（包括2695 四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱，2489 紫外检测器，Empower 色谱工作站）；超声波清洗器（SB25-12DTDN 型，宁波新芝生物科技股份有限公司）；循环多用真空泵（SHB-3 型，郑州长城科工贸有限公司）；BT-25S 电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；BS210S 电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2 试剂

盐酸药根碱（批号B21451，纯度≥98%）、非洲防己碱（批号B20391，纯度≥98%）、黄连碱（批号B20560，纯度≥98%）、表小檗碱（批号B20108，纯度≥98%）、巴马汀（批号B21433，纯度≥98%）、小檗碱（批号B21379，纯度≥98%），购于上海源叶生物科技有限公司。乙腈和氨水（色谱纯，美国Fisher 公司）；水为娃哈哈纯净水；其余试剂为分析纯。

1.3 药材

酒黄连饮片共20 批，其中S14、S15、S19、S20 为市售酒黄连，其他批次为根据优选工艺炮制的自制样品和中试样品，用于炮制的黄连药材经北京中医药大学中药鉴定系杨瑶君教授鉴定为毛茛科植物黄连（Coptis chinensisFranch.）的干燥根茎。各批酒黄连粉碎，过二号筛备用。酒黄连样品来源见表1。

表1 酒黄连样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：XtimateC18（4.6 mm*250 mm，5 μm）；流动相：A:30 mmol·L-1碳酸氢铵水溶液（1 000 mL碳酸氢铵水溶液含氨水7 mL、三乙胺1 mL），B：乙腈。乙腈梯度 洗 脱（0-12 min，10%-25%B；12-23 min，25%-30%B；23-35 min，30%-40%B；流速1 mL·min-1；检测波长270 nm；柱温30℃；进样量10 μL。该条件下，基线平稳、峰形较好，分离度符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

精密称取药根碱、非洲防己碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、小檗碱6 种对照品适量，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度。其中各成分浓度分别为123 μg·mL-1、122 μg·mL-1、214 μg·mL-1、123 μg·mL-1、315 μg·mL-1、413 μg·mL-1。

2.2.2 供试品溶液

按照2015 年版《中华人民共和国药典》黄连项下含量检测方法，精密称取20批酒黄连粉末（过二号筛）0.1 g，置具塞锥形瓶内，精密加入甲醇∶盐酸（100∶1）的混合液50 mL，称定重量，密塞，超声30 min（功率250 W，频率40 kHz），放冷，用甲醇补足失重，滤过，滤液过微孔滤膜（0.45 μm），即得供试品溶液，备用[1]。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：D809010101），按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，以巴马汀的保留时间和峰面积为参照，记录各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示13 个共有峰的相对保留时间的RSD 值在0.04%-1.37%之间，相对峰面积的RSD 在1.21%-4.84%（n=6），表明仪器精密度符合要求。

2.3.2 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：D809010101），分别在室温下放置 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以巴马汀的保留时间和峰面积为参照，记录各共有色谱峰的相对相对保留时间和相对峰面积。结果显示13 个共有峰的相对保留时间的RSD 值在0.01%-0.78%之间，相对峰面积的RSD值在1.10%-4.53%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：D809010101）0.1 g，共6 份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样，以巴马汀的保留时间和峰面积为参照，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。1-13 号峰的相对保留时间的RSD 值在0.02%-0.58%之间，相对峰面积的RSD 值在1.21%-4.89%之间。表明此方法重现性良好。

2.4 HPLC特征图谱的生成及相似度评价

2.4.1 HPLC特征图谱的生成

取20 批酒黄连粉末，按照“2.2.2”项下方法，制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。记录色谱图，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，分析20 批酒黄连的HPLC 色谱图，选取分离度、峰形较好的13 个峰为共有峰，得到特征图谱，见图1；药材的共有模式图谱见图2。8-13 号峰分别与药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的对照品保留时间相一致（混合对照品图谱见图3）。

2.4.2 相似度评价

图1 20批酒黄连的叠加特征图谱

图2 酒黄连对照样品的HPLC特征图谱

图3 混合对照品色谱图

以酒黄连样品的对照特征图谱为参照图谱，对20批酒黄连饮片的特征图谱进行相似度分析，分析结果见表2。20 批酒黄连样品的相似度为0.999-1.000，各批样品相似度差异小，表明饮片质量稳定。

2.5 聚类分析

本研究将20 批酒黄连特征图谱13 个共有峰的峰面积做标准化处理后作为变量，利用SPSS 19.0统计分析软件，采用系统聚类法结合欧氏距离（Euclidean distance）作为样品的测度，进行聚类分析。通过聚类分析可得到树状图，其中同组样本相关性较高，不同组样本相关性较小，树状图可以更加直观地分析各样本间的相关性，结果见图4。

由图 4 可知，d=20 时，20 批酒黄连可以分为 2 类，S4-S13 为一类，酒黄连药材产地为四川，S1-S3 及S14-S20 为一类，即酒黄连药材来源为重庆和湖北的分为一类。d=18 时，20 批酒黄连样品可以分为3 类，将产地为重庆和湖北的酒黄连区分开，在生物碱含量方面，S1、S2、S3聚为一类，生物碱含量较低；S4-S13聚为一类，生物碱含量高；S14-S20 聚为一类，生物碱含量较高。20 批酒黄连生物碱含量见表3，主要测定各批酒黄连中药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱等六种生物碱含量及总生物碱含量。聚类结果与其产地相一致，表明聚类分析可以用来区分不同产地和不同质量的酒黄连。

2.6 主成分分析

主成分分析是一个正交化线性变换的过程，通过线性变换，将原始数据中多个相关指标组合成几个综合指标（主成分），即原始指标的线性组合，综合指标可保留原始指标的主要信息，但互不相关，即主成分可代表原始数据，简化分析模型。

本研究中用SPSS 19.0 统计分析软件将20 批酒黄连13个共有峰的峰面积做标准化处理后，以主成分的特征值和贡献率为依据，对其进行主成分分析。主成分分析中坐标系的转化将数据变换到新的坐标系统中，每个变量在新轴上的投影称为其载荷，表示该轴上每个变量的相对重要性并有相关得分。为了使分析结果更加直观，主成分分析选取3个主成分，特征值分别为9.096、2.386、0.513，累积方差贡献率分别是69.968%、88.322%、92.271%，结果见表4。

表2 20批酒黄连样品相似度

图4 20批酒黄连聚类分析树状图

表3 20批酒黄连生物碱含量（n=2）

表4 2个主成分的特征值和方差贡献率

20 批酒黄连根据主成分得分 Y1、Y2、Y3作散点图分析其聚类结果。主成分分析聚类结果见图5，在主成分空间中距离较近的为同类样本，距离较远的为不同类样本。图5 显示20 批酒黄连可聚为三类，S1、S2、和 S3 距离较近，S4-S13 聚在一起，S14-S20 中 S17、S18、S19 在主成分空间中比较分散，此结果与聚类分析结果较一致。

3 讨论

本研究前期探究了酒黄连的较优炮制工艺。以炮制品外观性状和药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱等六种生物碱含量为指标综合评分，采用正交实验的方法，考察黄酒稀释倍数、闷润时间、炒制温度、炒制时间等因素对酒黄连质量的影响，优选出酒黄连的较优炮制工艺：取净黄连，加黄酒（黄酒进行稀释 1∶4）闷润 2 h，至液吸尽，（150±10）℃炒制20 min，每100 kg 黄连，用黄酒12.5 kg。经验证实验、中试实验表明该工艺稳定、可行。使用该工艺炮制的酒黄连及购买的酒黄连用作本研究中的样品。

本研究建立了酒黄连的HPLC 特征图谱并进行相似度分析。特征图谱的建立选择碳酸氢铵水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱；检测波长270 nm；柱温30℃；进样量10 μL的色谱条件，在此条件下基线平稳、峰形较好，分离度符合要求，具有较好的重复性和专属性。HPLC 法较为全面地反应了酒黄连饮片中化学成分的信息，选取分离度较好地13 个特征峰形成特征图谱，根据标准品对照可知8号峰为药根碱、9号峰为非洲防己碱、10号峰为表小檗碱、11号峰为黄连碱、12号峰为巴马汀、13号峰为小檗碱。相似度分析结果表明20批酒黄连相似度为0.999-1.000，相似度较高，20 批酒黄连饮片质量稳定。

图5 20批酒黄连主成分分析图

主成分分析和聚类分析是较为常用的多元统计方法，用于探索数据和分组之间的关系尚不清楚的样本之间的相似性和隐藏模式。主成分分析（PCA）可对大型多元数据集的变量进行重组，使重构数据集的前几个变量占数据方差的绝大部分，其目的是确定若干变量之间最重要的相关关系，以便在原始变量的基础上用很少的线性组合描述总体方差。聚类分析方法可发现各样本之间的相似性，根据相似性大小将样本聚类，并生成聚类图。聚类分析应用数据的所有方差进行分类，但会丢失每类中变量的相关关系信息；主成分分析选择的主成分代表60%-90%的原始信息，但可表明原始数据间的相关性，与单独使用这两种方法相比，将主成分分析与聚类分析结合使用可以提供更多的信息[20]。

在饮片质量稳定的基础上应用SPSS 19.0 数据处理软件根据特征图谱对20批酒黄连饮片聚类分析，表明聚类分析可对酒黄连进行较好地分类，分析结果为当欧式距离d=18 时，20 批酒黄连可分为三类：生物碱总含量较低的S1-S3，即产地为重庆的酒黄连聚为一类；生物碱总含量高的S4-S13，即产地为四川的酒黄连聚为一类；生物碱总含量较高的S14-S20，即产地为湖北的酒黄连聚为一类，表明基于生物碱成分含量差异评价酒黄连质量的差异与其产地有关。对酒黄连的特征图谱进行主成分分析，共选择了3个主成分，累积方差贡献率达到90%以上，各批饮片在主成分空间中相距较近的为一类，主成分分析同样将20批酒黄连分为三类：S1-S3 聚为一类；S4-S13 聚为一类；S14-S20 中 S17、S18、S19 在主成分空间中与其他批次距离较远，主成分分析结果与聚类分析结果相近，这表明两种分析结果的一致性和科学性。此外，聚类分析和主成分分析相结合可发挥二者的优势，相互验证、补充，实现快速分析。综上所述，本研究基于聚类分析和主成分分析研究酒黄连HPLC 特征图谱可作为酒黄连质量评价的方法和依据。