基于中药网络药理学研究青黛防治原发性胆汁性肝硬化的成分与作用机制*

徐 俊 戚 璐 程良斌 张誉丹 许 杰 楼汪洲洋

湖北中医药大学2018级博士研究生班 (湖北 武汉， 430065)

原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种主要累及肝内小胆管,造成胆汁淤积,引起肝脏炎症反应的自身免疫性肝病[1]。病情发展，逐渐步入肝纤维化、肝硬化，最终导致肝脏衰竭[2]。其病因尚不明确，目前研究认为与分子细胞免疫学、家族遗传易感性及胆汁酸的合成、分泌、转运障碍等相关[3]。PBC治疗的重点是抑制异常免疫反应，减轻淤积胆汁的毒性作用。目前临床尚缺乏特异性高、疗效好、副作用小的治疗药物[4]。中医药在治疗PBC等胆汁淤积性肝病(黄疸病)方面有着悠久的历史，具有特色优势。青黛为爵床科Acanthaceae植物马蓝、蓼科Polygonaceae植物蓼蓝、十字花科Brassicaceae植物菘蓝的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末、团块或颗粒[5]。具有清热解毒、凉血消斑，泻火定惊等作用[6]。网络药理学具有整体性、系统性的特点，与中医辨证论治的整体思想不谋而合。为了进一步诠释中药青黛活性成分和作用靶点、阐明防治PBC作用机制、发现中药组效关系、优化复方和寻找新药，笔者以青黛为对象，利用网络药理学，构建青黛“成分-靶点-通路-机制-PBC”网络，阐述青黛防治PBC多成分、多靶点和多通路的特点，为拓宽青黛临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)；人类孟德尔遗传(OMIM)数据库(http://www.omim.org/)；Pubmed数据库(http://pubmed.cn)；TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)； UltraEdit软件；Cytoscape3.7.1 软件；string数据库(https://string-db.org/)；Bioconductor数据库(http://http://bioconductor.org)；R软件；Perl软件。

1.2 方法

1.2.1 青黛化学成分收集 TCMSP数据库可以用于有效成分鉴定、药物靶点筛选和化合物靶标-疾病网络构建[7]。基于数据库样本数据复杂性与TCMSP用户指南，以口服生物利用度(OB)≥30%[8]，药物相似性(DL)≥0.18[9]为筛选条件，检索出青黛的有效化合物和关键靶点信息。

1.2.2 PBC靶蛋白的收集及前处理 打开GeneCards数据库，keywords中输入primary biliary cirrhosis进行检索，所得信息输出为Excel；打开OMIM数据库，在Advanced Search一栏中选GeneMap，再检索primary biliary cirrhosis，待搜索完毕，download为Excel格式

1.2.3 青黛-PBC靶蛋白交集的整理 整理出青黛的潜在靶蛋白与PBC相关靶蛋白，分别形成drug.txt和disease.txt两个文件，在R软件中安装“VennDiagram”数据包，用UltraEdit软件编写整理出靶蛋白交集的脚本，在R中运行，输出靶蛋白交集，为drug.disease.txt，并构成Venn图。

1.2.4 青黛“成分-靶点”网络与蛋白互作网络(PPI network)的构建与评估 根据中药成分、靶点之间的关系，建立活性成分-靶点网络，采用 Cytoscape 3.7.1进行网络可视化，并在R中用barplot函数绘制核心蛋白靶点的柱状图。根据1.2.3中得到的drug.disease.txt，检索string数据库，在Multiple proteins右边输入所有靶蛋白，在Organism下方选择Homo sapiens进行搜索，隐去孤立的蛋白靶点，以minimum required interaction score=0.4为评判标准，从而得到青黛防治PBC关键靶点之间的相互作用关系。

1.2.5 对关键靶蛋白进行GO和KEGG富集分析 根据1.2.3中得到的drug.disease.txt，在Bioconductor中找到“DOSE”、“clusterProfiler”、“pathview”3个安装包，在R中运行安装。之后用UltraEdit编辑运行GO和KEGG的脚本，在R中运行，得到GO分析散点图和数据结果，得到KEGG的柱状图、通路图和相关数据。

2 结果

2.1 青黛的化学成分检索情况 见表1。通过TCMSP数据库检索到青黛化合物29个。以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，筛选得到青黛活性化学成分9种。

表1 青黛的主要化学成分

2.2 青黛-PBC靶点交集 见图1。检索青黛相关靶点共208个，排除重复靶点和与9种有效成分无关靶点后，得到48个。经GeneCards数据库检索，与PBC相关靶点共有2050个,经OMIM检索，与PBC相关靶点有27个。两个数据库靶点汇合，排除重复靶点，共得到2069个靶点。通过在线Venn图得到药物和疾病共同的靶点32个，即青黛防治PBC的关键靶点。

图1 青黛-PBC靶点交集Venn图

2.3 青黛“成分-靶蛋白-通路”网络与蛋白互作网络建立

2.3.1 化合物-靶蛋白网络 见插页图2。运用Cytoscape3.7.1将青黛及其主要化学成分、关键靶蛋白与疾病关系可视化。如插页图2所示，红色为疾病(PBC)，绿色为青黛中药名，黄色为青黛主要化学成分，蓝色为关键靶点。

2.3.2 PPI网络 见图3。查询String数据库，将32个关键靶点蛋白进行PPI网络可视化，其中JUN、CASP3、PTGS20、GELA等靶点与较多的其他靶点相关联，为核心靶点。

图3 青黛防治PBC靶点相互作用网络图

2.4 GO分析结果 见插页图4。GO主要是进行靶蛋白功能分析。通过运算，与关键靶蛋白相关功能共有69种。根据相关性分析，青黛防治PBC主要是通过影响机体的核受体活性、转录因子活性、直接配体调节的序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性等而发挥作用。如插页图4所示，点状图颜色越红，点越大，相关性越高。

2.5 KEGG分析结果 见插页图5。通过关键蛋白在Bioconductor数据库中，找到与之相关通路109条，根据通路中所含关键靶蛋白数目和相关性评分，排名前20条通路为青黛防治PBC的关键通路，如插页图5所示，柱状图颜色越红，说明相关性越高。青黛防治PBC涉及IL-17信号通路、小细胞肺癌、乙型肝炎、弓形虫病、人巨细胞病毒感染、甲型流感、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、Epstein-Barr病毒感染、Chagas病(美国锥虫病)、人免疫缺陷病毒I感染、丙型肝炎、TNF信号通路、肺结核、凋亡、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、Th17细胞分化、凋亡-多物种、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号、神经营养因子信号通路。其中IL-17信号通路为重要通路。

3 讨论

目前PBC发病机制尚未明确，临床治疗存在一定难度。熊去氧胆酸(UDCA)是唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗PBC的药物[10]，早期应用可改善PBC患者的生化指标，长期服用可延缓疾病进展，并可减少肝硬化的发生，提高患者生存率[11]。但对于UDCA治疗是否可以延缓组织病理学进展尚有争议[12]，并出现了UDCA应答不佳和治疗不耐受的情况[13]。基于中医理论和临床实践，PBC病情进展的中医病机可概括为气滞→痰凝→血瘀→水停[14]。青黛具有清热解毒，清肝泻火，凉血止血功效，又有消痰散肿之长，契合PBC病机。现代药理研究证实青黛具有保肝、抗肿瘤、抗菌及类激素样作用[15]。

IL-17是Th17细胞的主要效应因子，参与炎性、肿瘤、自身免疫性疾病的发生和发展[16，17]。在机体出现感染或创伤的早期，Th17可以有效介导中性粒细胞产生趋化效应，参与阻止机体感染加重与组织坏死[18]。IL-17能抵抗多种病原体的感染，诱导分泌相关细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶，IL-17还可通过放大共刺激分子如细胞黏附分子的诱导作用，协同刺激T细胞的活化，在固有免疫和适应性免疫中起桥梁作用[19，20]。研究发现，肝内中、小胆管上皮细胞能表达IL-17受体，可与IL-17结合诱导胆管细胞分泌纤维化细胞因子IL-lβ、IL-6、IL-23等，促进肝脏慢性纤维化，在PBC患者肝硬化的发生机制中起着重要的作用[21]。也有研究表明，在PBC患者胆管上皮细胞表达IL-17受体，与IL-17结合反应产生更多炎症因子，如 IL-6、IL-1β 和 IL-23[22，23];Th17、Treg及相应细胞因子的异常参与自身免疫耐受的打破，导致肝脏内的胆管上皮细胞破坏。同时，相关研究也证实了在 PBC 患者中，Th17/Treg相关细胞因子IL-1β、IL-6 和 IL-23 明显增加[24]，并且容易出现Th17 分化和反向Treg分化[25]。

此次研究基于网络药理学方法对青黛药效成分进行靶标预测和通路分析，通过建立药效成分-靶点通路网络图，多角度探索青黛防治PBC潜在的作用机制，发现青黛中10h-吲哚[3,2-b]喹啉衍生物、糖苷等8个药效成分可能通过抗细胞凋亡、抗氧化应激反应、减少炎症反应等机制发挥抗PBC作用，为其后续临床试验疗效评价指标的筛选提供依据和方向。同时，对于文献中证明有治疗PBC作用的部分化合物，此次研究并未筛选得到，说明实验方法还存在一些局限性，网络药理学研究结果仍需要后续实验的验证与支持，并不断完善。