中药活性成分阿魏酸抗血小板活性和抗血栓作用的研究*

★ 刘海云 林倩霞 纪玉龙 支雪萍 李会丽 陈爱社 侯本超（.江西中医药大学 南昌 330004；2.南昌大学第一附属医院 南昌 330029）

血栓性疾病的病因及发病机制十分复杂，当血管内皮损伤，继而血小板数量增加，人体凝血活性显著增强而抗凝活性降低，导致血栓形成，其临床病理过程还包括血栓栓塞。近年来血栓性疾病位居广大疾病病因之首，具有高致死率和高致残率，包括有缺血性中风、冠心病、急性冠状动脉粥样综合征、肺栓塞、外周血管疾病等，严重威胁人类的生命健康［1］。在血栓以及动脉粥样硬化的形成过程中，血小板起着重要的作用，其中血小板活化异常是血栓形成的重要病理学基础［2］。抗血小板药物可抑制血小板活化，对上述疾病有一定疗效。因此具有抗血小板活性的药物对于防治血栓有着重要作用。

阿魏酸是桂皮酸衍生物，易溶于热水，难溶于苯，伞形科植物，化学名称为4-羟基3-甲氧基肉桂酸。阿魏酸熔点为174 ℃，性质稳定，顺式为黄色油状物，反式为纤维状结晶，合成方法简单快速［3］。阿魏酸也是一种功能性酚酸，具有强大的抗氧化活性，存在于植物细胞壁中，也可使人体产生自由基的酶受到抑制同时清除自由基的酶增加，起到未病先防的作用。因此阿魏酸多领域有着多种用途。它在医疗医药、美容医学、化妆品护肤品原料等有着独特的作用，主要由于其对皮肤结构具有保护作用，主要作用于角质形成细胞，成纤维细胞，纤维母细胞，胶原蛋白，弹性蛋白。它抑制黑色素生成，增强表皮抵抗力，增强血管生成，增强新陈代谢并加速伤口愈合。作为光保护剂，延缓皮肤光敏感过程和皮肤老化而广泛用于护理类制剂中。它不仅存在于粗粮、坚果、干果、绿叶蔬菜等食物中，更广泛存在于多种中药中如：活血化瘀的当归、川芎，清热的木贼、升麻、梓白皮，宁心安神的酸枣仁等［4-5］。

药理研究和临床应用表明，阿魏酸钠具有保护心血管和拮抗内皮素生成等功效，以及还具有抑制炎性介质生成、抗血栓形成等作用，具有广阔的挖掘潜力。阿魏酸毒性低，具有多种生理功能（抗炎，抗肿瘤，抗氧化，抗老化，抗微生物活性和抗糖尿病作用）。血液流速减慢，粘稠度升高，血小板聚集和血栓形成是导致出血性和缺血坏死性疾病的病理学基础。心脑血管疾病与血小板活性、凝血因子活性、血液粘稠度和血栓形成密切相关，为此本文研究阿魏酸抗血小板聚集、抗凝血及抗血栓形成作用，并阐明其作用机理。阿魏酸有顺式和反式两种结构，虽然一些文献表明阿魏酸抗血栓有一定作用但并未说明是哪种结构发挥作用。本文从研究阿魏酸反式结构着手进一步研究其是否具有抗血小板活性及抗血栓的作用，从而来明确抗血栓的结构类型，为其在心血管类疾病治疗方面的应用提供实验和理论依据。

1 材料

1.1 动物 购入昆明种小鼠（雌雄各半）40 只，体重在18～22 g 范围内；SD 大鼠，雄性，体质量300～350 g；由江西中医药大学实验动物中心提供，许可证号SYXK（赣）2015-0026。将小鼠置于室温20 ℃～22 ℃，空气湿润新鲜，采光和通风良好的环境中培养。均以固体饲料喂养，雌雄分笼放置，可自由活动饮水。预培养1 周左右，每日观察大小鼠的精神状态，正式开始实验。

1.2 试剂 阿魏酸（浙江银和药业有限公司）；凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）试剂盒均为上海太阳生物技术有限公司产品，批号分别是20120116，20120316，20121117，20120124；阿 司 匹 林 购自 于Sigma 公 司（50 Fmol/L）；Fura-2（购 自 于Sigma 公司），其他生化试剂均为国产分析纯。乌拉坦（上海展云化工有限公司，批号：120314）；阿司匹林肠溶片（沈阳奥吉娜药业有限公司，批号：20065051），二磷酸腺苷adeno-sine diphosphate，ADP，上海丽珠东风生物技术有限公司）

1.3 仪器 微量进样器（德国eppendorf 公司），恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），AdventurerTM 电子天平（奥豪斯国际贸易有限公司），TGL-16G 型台式高速离心机（上海市实验仪器总厂），TECAN 酶标仪sunrise（奥地利TECAN 公司），SYSMEXCA-1500 血凝仪（SYSMEX公司）；TYXN-91 智能血液凝聚仪（上海通用机电技术研究部）。

2 方法

2.1 动物分组与给药 SD 大鼠50 只，随机分为5组，每组10 只。组一命名为空白对照组（给予等量生理盐水）、组二命名为阳性对照组 （给予阿司匹林30 mg·kg-1）、组三命名为阿魏酸低剂量组（给予7.5 mg·kg-1）、组四命名为中剂量组（给予15 mg·kg-1）、组五命名为高剂量组（30 mg·kg-1）。各组动物均灌胃给药，连续7 d；小鼠50 只，随机分为5 组 ，每组10 只，按大鼠的分组方法和剂量给药7 d。阿魏酸的剂量设置参照文献［6］。

2.2 中药阿魏酸对大鼠凝血功能的影响［7］末次给药2 h 后腹腔注射20 %氨基甲酸乙酯1 mL/Kg，麻醉大鼠，按照无菌操作，腹主动脉采血，采用3.8%柠檬酸钠抗凝，血液与抗凝剂之比为9∶1，然后以2500 r·min-1离心10 min，取血浆。按试剂盒说明测定TT、PT 和APTT。

2.3 对小鼠凝血时间的影响［8］本实验采用毛细玻璃管法测定全血凝血时间。每组大鼠小鼠按照“2.2”中分组方法与剂量给药7 d，记录每次给药时间。于末次给药后2 h 用直径1 mm 的玻璃毛细管插入小鼠眼底静脉丛取血，血液迅速流入毛细玻璃管，当毛细管血液被注满后使其平放于桌上，开始计时，每隔20 s 折断两两端毛细玻璃管，并缓慢向左右拉开，直至出现血凝丝停止计时，所得时间即为小鼠凝血时间（CT）。

2.4 对大鼠动一静脉血流旁路血栓形成的影响［9］按照“2.2”中的动物分组、方法与剂量规律给药7 d。末次给药2 h 后，腹腔注射20%氨基甲酸乙酯1 mL/Kg，麻醉大鼠，严格按照无菌操作，将大鼠固定于手术架，颈部剪毛，消毒，铺巾，提捏颈部，在正中剪3 cm 切口，逐层分离，充分暴露出右颈总动脉和左颈外静脉，动作轻柔避免牵拉，然后取一根由三段聚乙烯管组成的套管，水平放置，在管中段放一根6 cm 长度的精密质量的4 号手术丝线，注入肝素生理盐水溶液（50 u·mL）充满聚乙烯管，轻柔稳定插进分离出的右颈总动脉和左颈外静脉，防止溶液溢出，动-静脉血流旁路开放15 min 后中断血流，迅速取出丝线称质量，总质量减去丝线质量即得血栓湿重，60 ℃干燥30 min，称量干重，并计算血栓抑制率。

抑制率=（空白组血栓质量-给药组血栓质量）/空白组血栓质量×100 %

2.5 统计处理 用统计分析软件SPSS 17.0 对各组实验数据进行处理分析，实验结果用表示，用LSD 法行组间两两分析并进行比较，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 阿魏酸对大鼠凝血功能的影响 与正常对照组比较，阿魏酸小剂量组对延长TT、PT、APTT 的作用不明显，差异无统计学意义；阿魏酸中、大剂量组和阿司匹林显著延长TT、PT、APTT，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。见表1。

表1 阿魏酸对大鼠凝血功能的影响（，n=10）组别 剂量/mg.kg-1 PT/s TT/s APTT/s正常对照组（生理盐水） - 14.12±0.51 18.43±0.15 29.12±0.25阿司匹林组 30 23.14±0.321） 30.12±0.331） 42.62±0.321）低剂量给药组 7.5 15.19±0.32 19.24±0.14 31.43±0.672）中剂量给药组 15 21.09±0.242） 25.21±0.281） 35.51±0.251）高剂量给药组 30 28.32±0.121） 41.34±0.341） 24.11±0.621）注：与生理盐水组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

3.2 对小鼠凝血时间的影响 实验结果证明，与对照组比较，实验组中阿魏酸低剂量组CT 延长不明显，而阿魏酸中、高剂量组和阳性对照组（阿司匹林）CT 明显延长（P＜0.05、P＜0.01），其延长率分别为28.9 %、46.7 %，见表2。

3.3 对大鼠动一静脉旁路血栓形成的影响 结果表明，与正常对照组比较，阿魏酸低、中、高剂量组和阿司匹林组均明显减轻血栓湿重（P＜0.01，P＜0.05），有统计学意义。阿魏酸低、中、高剂量组对大鼠动一静脉旁路血栓抑制率分别为14.28 %，20.69 %和32.65 %（P＜0.05），见表3。

表2 对小鼠凝血时间（CT）的影响（，n=10）组别 剂量/mg.kg-1 CT/s 延长率/%正常对照组（生理盐水） - 300.42±43.15 -阿司匹林组 30 510.04±68.621） 60.5低剂量给药组 7.5 332.25±48.242） 8.4中剂量给药组 15 350.09±51.431） 28.9高剂量给药组 30 406.18±58.161） 46.7注：与正常对照组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

表3 对大鼠动一静脉旁路血栓形成的影响（，n=10）组别 剂量/mg.kg-1 湿重/mg 干重/mg 抑制率/%正常对照组（生理盐水） - 40.42±1.15 18.26±0.64 -阿司匹林组 30 21.32±1.261） 11.32±0.621） 37.23低剂量给药组 7.5 36.69±2.122） 16.42±1.23 14.28中剂量给药组 15 30.09±2.421） 14.21±1.382） 20.69高剂量给药组 30 23.76±3.821） 12.78±1.221） 32.65注：与生理盐水组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

4 讨论

随着生活水平的提高，心血管疾病的发病率也逐年增加，血栓性疾病占心血管疾病的比例很高。据数据统计，我国血栓性疾病患者超过1 千万，发病率远高于其他疾病，且有逐年递增的趋势［1］，其中血小板功能异常导致的血栓疾病是心血管疾病发病的主要原因［10］。抗血栓的西药存在很大的副作用，所以选用副作用小又有效的中药是切实可行的方法，对临床防治抗血栓形成具有重要意义。

血栓的形成与血小板的聚集、黏附及释放反应有关。血液凝固包括内源性凝血和外源性凝血两种途径。内源性凝血是由十二凝血因子启动的，通过激活血小板的膜表面磷脂。外源性凝血是组织损伤由血管外的组织因子释放入血而启动的凝血过程。凝血时间和凝血酶原时间可以反映内外源性凝血的功能状况［11］。

凝血功能指标PT、TT、APTT 在一定程度上能够反映机体凝血系统的状态，APTT 和TT 可以反映内源性凝血的功能状态，PT 是反映外源性凝血途径的指标。本实验结果表明阿魏酸明显延长了大鼠血浆中PT、TT、APTT，说明阿魏酸能抑制内、外源性凝血，从而抑制凝血酶的活性达到抗血栓的作用。

小鼠出血时间主要反映血小板的功能。出血时间的长短与血小板的数量和功能、毛细血管功能、凝血因子及纤溶等因素有关，毛细血管功能和血小板对其的影响最大。本实验结果表明阿魏酸明显延长小鼠的出血时间，其原因可能是通过抑制血小板活性实现的。

血管内皮破坏、血小板功能异常以及血流改变与淤积是血栓形成的三个因素［12］。而血小板粘附聚集是血栓形成过程中很重要的一步，通过阻断血小板活化或抑制与其它配体结合可以影响血小板粘附聚集［13］。血小板的黏附性是血小板与粗糙物接触，黏附于其表面，是一项重要的止血功能。血小板黏附率越高，聚集性越强，血液粘稠度增高，易形成血栓。动静脉旁路血栓模型的建立是用于测量整体血流中血液速度、血液粘稠度及血小板的吸附能力和聚集的影响［14］。血小板功能的异常是血栓结构能够形成的直接原因，该血栓模型类似动脉中的白色血栓，比较接近人体的生理与病理状态［15］。动脉血流中的普遍广泛存在的血小板一旦接触粗糙物表面，血小板的粘附性立马表现出来，随着动脉血流动，血液粘稠度迅速升高，血液中累积的血小板聚集环绕在粗糙物表面而快速形成血小板血栓。形成的血栓湿重越小，对应的血栓形成抑制率就越大。本实验结果表明中药各组及阳性对照组均可减轻动静脉旁路形成的血栓干湿重，证明中药阿魏酸对血栓形成具有一定的抑制率。

综上所述，中药活性成分阿魏酸可以延长小鼠凝血时间，中高剂量组明显延长大鼠PT、APTT、TT， 中药各剂量组明显减轻动静脉旁路血栓干重和湿重，明显增加了血栓抑制率，从而达到抗血栓的作用。由此表明，阿魏酸具有显著抗血栓的功效，其抗血栓的作用可能与改善凝血功能、血小板聚集黏附功能有关。