新型冠状病毒肺炎患者外周血四类淋巴细胞的检测与分析

周国忠 杨明霞 钱颖

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是新型冠状病毒引起以肺炎为主的感染性疾病[1]，临床表现差异较大，轻症患者（约占80.9%）临床表现为发热、乏力和干咳，少数伴有流涕、咽痛、鼻塞和腹泻等症状；而危重症和重症患者（约占19.1%）在发热后高烧不退，1周后出现呼吸困难和低氧血症，救治难度大，死亡率高[2-3]。COVID-19患者的机体免疫系统功能状况是决定病情发展和预后的重要因素。本研究分析COVID-19患者血液中自然杀伤性T细胞（NKT细胞）、T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞百分比及浓度的变化，并探讨这些变化的临床意义，以期为判断病情和选择适当的治疗方案提供更多的理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2020年1至2月本院收治的COVID-19患者26例，男15例，女11例，年龄27～85岁。临床表现以发热、乏力和干咳为主，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状，胸部检查两肺早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显，进而发展为多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变。参照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第五版修正版）》[4]，分为普通型（发热、呼吸道等症状，影像学检查可见肺炎表现）、重型[呼吸窘迫，呼吸≥30次/min；静息状态下，脉搏血氧饱和度≤93%；PaO2/吸氧浓度（FiO2）≤300 mmHg]和危重型（出现呼吸衰竭，且需要机械通气；出现休克；合并其他器官功能衰竭需ICU监护治疗）。本研究中普通型14例，重型12例，无危重型。本研究经本院医学伦理委员会审批通过。

1.2 方法 采用EDTA抗凝管采集COVID-19患者住院第2天（治疗前）清晨静脉血2 ml备用，将患者最后1次抽血检测结果作为治疗后数据。采用Navios流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）检测T淋巴细胞亚群（CD3、CD4、CD8）、B 淋巴细胞（CD19）、NK 细胞和 NKT细胞百分率；采用淋巴细胞亚群检测试剂盒（美国BD公司）绝对计数双平台法检测上述淋巴细胞浓度。均按照试剂说明书操作。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验。判断模型拟合能力的指标采用ROC曲线分析AUC、一致率，Youden指数=灵敏度+特异度-1，根据最大Youden指数确定最佳临界点。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重型COVID-19患者治疗前后各淋巴细胞情况的比较 重型COVID-19患者治疗后无一例死亡。与治疗前比较，重型COVID-19患者治疗后CD3细胞百分率明显升高（P＜0.05），CD4和CD8细胞百分率明显增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）；CD3、CD4、CD8、CD19和NKT细胞浓度均明显增加，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与治疗前比较，患者康复后NK淋巴细胞浓度和百分率均明显下降（均P＜0.05）。见表1。

表1 重型COVID-19患者治疗前后各淋巴细胞情况的比较

2.2 普通型COVID-19患者治疗前后各淋巴细胞情况的比较 普通型COVID-19患者无一例死亡。与治疗前比较，普通型COVID-19患者CD3细胞百分率和浓度明显升高（均 P＜0.05）；CD4、CD8和CD19细胞百分率明显增加，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）；CD8和CD19细胞浓度均明显增加（均P＜0.05），NK淋巴细胞百分率明显下降（P＜0.05）。见表2。

2.3 普通型组和重型组治疗前淋巴细胞情况的比较与普通型组治疗前比较，重型组治疗前CD3、CD8、NKT细胞百分率均明显降低（均P＜0.05），CD19和NK细胞百分率明显升高（均 P＜0.05），CD3、CD4 和 CD8、NKT细胞浓度均明显下降（均P＜0.05），NK细胞和CD19细胞浓度升高，但差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

2.4 普通型组和重型组治疗后淋巴细胞情况的比较与普通型组治疗后比较，重型组治疗后CD3细胞百分率明显下降（P＜0.05），CD4、CD8和NKT细胞百分率均明显下降，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）；CD19和NK细胞百分率上升但差异无统计学意义（P＞0.05）；NKT、CD3、CD4、CD8 细胞浓度均下降（均 P＜0.05），NK细胞浓度升高（P＜0.05），见表4。

表2 普通型COVID-19患者治疗前后各淋巴细胞情况的比较

表3 普通型组和重型组治疗前淋巴细胞情况的比较

2.5 各淋巴细胞在COVID-19诊断中ROC曲线分析结果 为方便统计及分析，除了CD19细胞百分率、NK细胞百分率、CD19细胞浓度和NK细胞浓度，剩余8个指标均用倒数绘制ROC曲线，见图1。

由图1可见，ROC曲线分析显示，1/CD3的AUC为0.924，95%CI：0.000～1.000，标准误 0.001（P＜0.05），灵敏度0.818，特异度0.833，最大Youden指数0.651。1/CD4的 AUC 为 0.799，95%CI：0.616～0.982，标准误0.015（P＜0.05），灵敏度1.000，特异度 0.500，最大 Youden指数为0.500。1/CD8 的 AUC 为 0.811，95%CI：0.627～0.994，标准误 0.012（P＜0.05），灵敏度 0.909，特异度 0.500，最大Youden指数为 0.409。1/NKT的 AUC为 0.758，95%CI：0.552～0.963，标准误 0.036（P＜0.05），灵敏度 0.909，特异度0.667，最大Youden指数为0.567。CD19的AUC为0.867，95%CI：0.698～1.000，标准误 0.003（P＜0.05），灵敏度0.909，特异度0.583，最大Youden指数为0.492。1/CD3 的 AUC 为 0.795，95%CI：0.598～0.996，标准误 0.016（P＜0.05），灵敏度 0.818，特异度 0.750，最大 Youden 指数为 0.568。1/CD4 的 AUC 为 0.795，95%CI：0.586～1.000，标准误 0.016（P＜0.05），灵敏度 0.909，特异度 0.750，最大Youden指数为0.659。1/CD8的AUC为0.856，95%CI：0.648～1.000，标准误 0.004（P＜0.05），灵敏度 0.818，特异度0.917，最大Youden指数为0.735。1/NKT的AUC为 0.875，95%CI：0.648～1.000，标准误 0.002（P＜0.05），灵敏度1.000，特异度0.500，最大Youden指数为0.500。

表4 普通型组和重型组治疗后淋巴细胞情况的比较

图1 各淋巴细胞在新型冠状病毒肺炎（COVID-19）诊断中ROC曲线

3 讨论

新型冠状病毒进入机体内会损伤肺部组织、激活免疫系统，因此大多数患者会出现发热（特别是高热）、干咳、乏力，小部分患者会出现流涕、鼻塞、咽痛、腹泻、呼吸困难等，严重者可进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克和出凝血功能障碍等症状[5]。普通的流感病毒也会引起肺炎和心脏衰竭等并发症，但是COVID-19导致肺部出现严重的感染，而且机体出现肺炎的概率更高[6]。

本院是COVID-19收治的定点医院，26例患者均康复出院，治愈率100%，患者体温恢复正常，临床症状好转，肺部炎症吸收，病毒核酸检测阴性。在治疗过程中，需要加强免疫系统，配合抗病毒药物的应用，以及结合各种支持疗法，大多数新冠肺炎患者可被治愈。因此了解COVID-19感染者的免疫状况，配合诊疗程序，非常必要。

当新型冠状病毒病原体进入机体时，免疫系统产生免疫反应，多种免疫细胞参与其中。CD3、CD4、CD8和CD19细胞属于适应性免疫应答细胞，它们之间相互制约、平衡，参与体液免疫和细胞免疫，反应机体当前的免疫功能、状态和平衡水平[7-8]。淋巴细胞百分率或计数绝对值可用于区别和监测某些免疫缺陷病和自身免疫性疾病。本研究结果显示，与治疗前比较，患者合理治疗后处于康复状态期间，治疗后的T细胞和B细胞数量均显示增加，NK细胞数量显示下降趋势，免疫功能有明显改善；与普通型组治疗前比较，重型组治疗前T细胞NKT细胞下降明显（P＜0.05），显示免疫系统受到明显抑制导致患者病情加重。可见这些细胞在数量上或功能上发生变化，机体免疫平衡将被打破，导致疾病发生或病情恶化。以往研究发现SARS患者的外周血CD3、CD4、CD8细胞均明显降低，尤其是CD4细胞降低最为明显，反映出患者机体的免疫功明显被抑制，这可能是病毒的直接作用。作为与SARS同源性的新型冠状病毒，通过比较急性期普通型、重型COVID-19的T淋巴细胞数量，患者免疫功能与分型相关，随疾病加重减低。在康复出院期，T淋巴细胞不同程度得到了恢复，普通型基本恢复正常，而重型虽然有所恢复，但还是低于普通型。实验显示，CD3、CD4、CD8细胞数量与患者的预后相关，若CD3、CD4、CD8细胞浓度和百分比较高，则预后较好。

固有免疫，包括NK和NKT细胞介导的免疫反应在病毒感染中的作用逐渐引起人们的重视[9]。NKT细胞是一种非传统T淋巴细胞，既表达自然杀伤性细胞的相关受体，也表达T细胞受体[10]。主要参与机体的固有免疫，同时也是适应性免疫的参与者和调节者。在新型冠状病毒炎症感染中，NKT细胞作用复杂多变，有待深入研究。文献表明NKT细胞是病毒感染早期的免疫细胞来源，能促进其它细胞如NK细胞的活化，发挥抗病毒作用[11]。NKT细胞经活化后能增强早期的抗流感病毒免疫反应[12]。NKT细胞在感染疾病中的作用机制包括抗感染免疫保护或免疫病理损伤机制还有待进一步研究。活化的NKT细胞能够快速、大量分泌Th1、Th2类细胞因子，因此NKT细胞尽管在人体中的数量很少，但在抗感染、抗肿瘤、抑制移植排斥反应、调节多种自身免疫性疾病和炎症性疾病中起到重要作用。在病毒感染和炎症诱导下，NKT细胞受到刺激后，分泌大量的IL-4、IFN-γ、GM-CSF、IL-13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用，NKT细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一[13]。NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，主要效应分子为穿孔素，Fas配体以及IFN-γ[14]。实验结果显示，与普通型组治疗前比较，重型组的NKT细胞百分率和浓度均下降（均P＜0.05）。可见，新型冠状病毒不同临床症状恶化，NKT细胞浓度有统计学差异，反映机体不同的免疫水平。

综上所述，新型冠状病毒炎症感染，NKT、CD3、CD4、CD8、NK和B淋巴细胞的百分率和浓度波动明显，在诊疗中起着关键作用，可作为治疗新型冠状病毒疾病的靶点。