HPLC-MS/MS法测定腌制食品中色素含量的预处理方法比较

钟萍，陈鲜丽，罗威，*，李亚楠

（1.湛江幼儿师范专科学校，广东湛江524084；2.岭南师范学院基础教育学院，广东湛江524037；3.韶关学院医学院，广东韶关512026）

苏丹红I～IV、苏丹红G、苏丹橙G和苏丹红7B均为合成色素，既可用于石油、机油等化工产品的调色，也可用于皮革、纺织品或家具的涂染[1-2]。由于上述化合物的结构中均有偶氮结构，人体若长期接触，会对肝、肾脏器产生强烈毒性作用，并有致癌风险[3-4]，因此国内外食品安全监管部门明确要求，不允许将其作为食品添加剂使用，因此建立高效、灵敏、准确的检测方法，对相关食品的安全监管意义重大。

目前苏丹红I～IV、苏丹红G、苏丹橙G和苏丹红7B的检测方法主要有紫外分光光度法[5]、薄层色谱法[6]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]、高效液相色谱-质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）[9-10]、气相色谱法[11]及酶联免疫检测法[12]等。其中以HPLC法和HPLC-MS/MS法应用最为常见，但高效液相色谱法的灵敏度较低，且易受共存组分的干扰，而其与质谱联用后，可克服上述缺点，具有灵敏度高、选择性强且定性与定量准确等特点，利于排除液相色谱的假阳性结果，因而利用HPLCMS/MS法检测腌制肉类食品中合成色素的研究被广泛报道[13-15]，但不同预处理样品方法对测定结果的影响，却鲜有提及。因此，本研究分别采用液液萃取-凝胶渗透色谱（liquid liquid extraction-gel permeation chromatography，LLE-GPC）法、固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）和QuEChERS法预处理腌制肉类食品后，利用HPLC-MS/MS法测定合成色素的含量，从而为相关食品中合成色素的定量检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV、苏丹红G、苏丹橙G和苏丹红7B标准物质（纯度≥90.0%）：上海安谱科学仪器有限公司；腊肠：市售；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸铵、乙酸乙酯、环己烷、正己烷、二氯甲烷均为色谱纯：德国默克公司；乙酸、无水硫酸钠均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；硅胶（C18）填料、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）填料、Bio-Beads S-X3填料：天津博纳艾杰尔科技有限公司；试验用水为高纯水（电阻率大于18.2 MΩ·cm）。

PL-GPC220凝胶渗透色谱仪、Agilent 1200高效液相色谱：美国安捷伦科技公司；API 4000四极杆质谱仪：美国PE公司；ME204电子天平：梅特勒-托利多公司；LG-22M高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；FV64全自动氮吹浓缩仪：广州得泰仪器科技有限公司；FRQ-1020超声波清洗器：温州百亚超声设备有限公司；XH-D涡旋混合器上海冠森生物科技公司；HN-98IB组织匀浆机：上海达洛科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

1.2.1.1 混合标准储备液配制

分别准确称取苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV、苏丹红G、苏丹橙G和苏丹红7B标准物质10.0 mg（精确至0.000 1 g），共置于100 mL容量瓶内，用乙腈稀释至刻度线定容、摇匀，即得0.1 mg/mL混合标准储备液。

1.2.1.2 混合标准溶液配制

分别精密移取上述混合标准储备液0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 mL，置于 100 mL 容量瓶内，用乙腈稀释至刻度线定容、摇匀，配制成浓度为0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 μg/mL的混合标准溶液，现用现配。

1.2.2 仪器工作条件

1.2.2.1 凝胶渗透色谱条件

凝胶色谱柱（400 mm×25 mm），填料为Bio-Beads S-X3（0.037 mm～0.075 mm）；淋洗液：乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比）；流量：5.0 mL/min；进样体积：5 mL。

1.2.2.2 液相色谱条件

Agilent Zorbax SB C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为 30 ℃；流量为 1.0 mL/min；进样体积10 μL；流动相：流动相A为0.1%（体积分数）甲酸、流动相 B 为乙腈；梯度洗脱程序：0～4 min 60%B；6 min～8 min时，B线性升高至100%；10 min～12 min时B线性降低至60%后，保持8 min。

1.2.2.3 质谱条件

电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；扫描方式为正离子扫描模式；检测方式为多反应监测模式（multi-reaction monitoring，MRM）；离子源温度600℃；气帘气流量30 L/min；雾化气流量40 L/min；辅助干燥气流量50 L/min；喷雾电压为5 200 V。

MRM监测模式下7种合成色素的特征离子及其它质谱参数见表1。

表1 7种合成色素的质谱参数Table 1 Optimal mass parameters for the seven kinds of synthetic colorants

1.2.3 LLE-GPC法

1.2.3.1 样品制备

超市购置的腊肠食品，捣碎后混匀，置于组织匀浆机内，完全粉碎制得供试样品。

1.2.3.2 待测物提取

准确称取粉碎完全后的样品2.0g（精确至0.0001g），置于50 mL聚四氟乙烯离心管内，精密移取20 mL乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比），摇匀后涡旋振荡15 min后，加入2 g无水硫酸钠，继续振荡10 min后静置至上层溶液澄清，离心7 min后（转速：4 500 r/min），吸取上清液，重复上述步骤，合并两次提取液，过0.45 μm滤膜，即得提取溶液。

1.2.3.3 GPC纯化

精密移取提取溶液10 mL，采用1.2.2.1凝胶渗透色谱条件净化1.2.3.2中提取液，收集22 min～28 min洗脱液后，于40℃氮气浓缩蒸干，残余物采用乙腈定容至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，上样至高效液相色谱串联质谱仪中检测。

1.2.4 SPE纯化

精密移取提取溶液10 mL至活化后的Thermo SCX固相萃取柱，经50 mL正己烷淋洗去除油脂后，采用20 mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气浓缩蒸干，采用乙腈定容至1 mL后，过0.22 μm滤膜，待测。

1.2.5 QuEChERS法

准确称取粉碎完全后的样品2.0g（精确至0.0001g），置于50 mL聚四氟乙烯离心管内，加入20 mL乙腈-水（1∶1，体积比），涡旋振荡15 min后，加入2 g无水硫酸钠，继续振荡 10 min，离心 7 min后（转速：4 500 r/min），吸取上清液，重复上述步骤，合并两次提取液后，精密移取10 mL，加入至装有100 mg硅胶（C18）吸附剂的聚四氟乙烯离心管内，涡旋振荡5 min后，离心5 min（转速：4 500 r/min），吸取上清液，过 0.22 μm 滤膜，待测。

1.2.6 基质干扰评价

为评估不同预处理方法的试验条件对基质干扰的去除效果，在乙腈和空白腊肠中分别加入等体积1.0μg/mL的混合标准溶液，照公式：基质效应（ME/%）=|（A/B-1）｜×100，（式中：A为空白腊肠中色素的质谱响应强度；B为乙腈中色素的质谱响应强度）计算采用不同预处理方法试验条件的基质效应。参考相关文献评价标准[16]，当ME/%＜10%不存在基质干扰，10%＜ME/%＜20%时，为低程度干扰，20%＜ME/%＜50%时，为中程度干扰，ME/%＞50%时，则基质严重干扰目标化合物的测定。

2 结果与分析

2.1 不同化合物的色谱图

根据7种合成色素的特征离子，在MRM监测模式下不同化合物的总离子流图，见图1，LLE-GPC法中凝胶渗透色谱分离，见图2。

图1 7种合成色素的总离子流色谱图Fig.1 The total ion chromatogram of seven kinds of synthetic colorants

2.2 线性范围与检出限

图2 GPC纯化加标样品色谱图Fig.2 The Gel permeation chromatogram

采用标准加入法，利用HPLC-MS/MS法测定不同质量浓度的混合标准溶液，以质谱响应强度（y）作纵坐标，7种合成色素的质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，同时以3倍信噪比（S/N）为检测限，以10倍信噪比（S/N）为定量限，得到不同分析物在一定线性范围下的回归方程、相关系数及检测限与定量限，结果见表2。

2.3 LLE-GPC法条件优化

2.3.1 提取溶剂选择

提取溶剂对目标化合物的提取效率直接影响测定结果的准确度，为保证样品中目标化合物完全富集，选择不同提取溶剂，照1.2.3.2步骤，分别萃取1.2.6中样品溶液，考察正己烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比）和乙酸乙酯-正己烷（1∶1，体积比）对基质效应的影响，结果发现，不同提取溶剂的ME/%均低于10%，但考虑后续凝胶色谱净化的洗脱液为乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比），因此确定乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比）为提取溶剂。

表2 线性范围、线性回归方程、方法检测限与定量限Table 2 Linear ranges，linear regression equation，limit of detection and limit of quantitation

2.3.2 提取次数选择

提取次数间接反映提取效率，照1.2.3.2步骤，分别考察提取次数对基质效应的影响，结果发现，样品溶液经两次提取后，对不同色素的基质效应可降低至5%以下，因此确定提取次数为两次。

2.4 SPE法条件优化

2.4.1 固相萃取柱选择

固相萃取需利用固相萃取柱选择性吸附目标化合物，经液相淋洗除杂后，再选择性洗脱待测组分，从而实现待测物的分离、净化与富集，因此选择不同类型固相萃取柱，照1.2.3.2步骤，分别处理1.2.6中样品溶液，考察 Dikma ProElut Silica、Agilent Bond Elut PSA、Thermo SCX固相萃取柱对基质效应的影响，结果见图3。

图3 固相萃取柱对基质效应的影响Fig.3 The effect of solid phase extraction column on matrix effect

从图3可知，相较其它两种固相萃取柱，采用Thermo SCX固相萃取柱的基质效应可降低至10%以下，这归因于待测7种合成色素的化学结构中均存在苯环偶氮结构，易形成季铵盐阳离子，构成π-π共轭稳定体系，而Thermo SCX固相萃取柱的固定相为苯磺酸基，具有强阳离子交换作用[17]，因此对上述合成色素均有较好保留，从而可有效去除基质干扰，因此选择采用Thermo SCX固相萃取柱。

2.4.2 洗脱剂选择

提取溶液上样至固相萃取柱后，经正己烷洗涤去除油脂、蛋白质和非极性的杂质后，采用洗脱剂选择性洗脱待测组分，因此考察等体积的不同洗脱剂（甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷）对基质效应的影响，结果发现，与其它洗脱剂相比，二氯甲烷对目标化合物检测的基质效应，可降至最低，因此采用二氯甲烷作为洗脱剂。

2.5 QuEChERS法条件优化

2.5.1 提取剂选择

由于7种合成色素的水溶性较好，化学性质相近，因此分别选择等体积的不同溶剂（乙腈、乙腈-水（1∶1，体积比）、水、甲醇、甲醇-水（1∶1，体积比））作为提取剂，照1.2.5步骤，预处理1.2.6中样品溶液，考察对基质效应的影响，结果发现，当采用乙腈-水（1∶1，体积比）提取时，对7种合成色素检测的平均基质效应最低（4.7%），这可能归因于乙腈-水（1∶1，体积比）提取目标物和其它极性杂质后，加入无水硫酸钠发生盐析效应，促使乙腈与水分层，从而除去溶于水相的蛋白质、糖分等杂质[18]，因此选用乙腈-水（1∶1，体积比）作为QuEChERS法预处理的提取剂。

2.5.2 吸附剂选择

QuEChERS法常用 C18、N-丙基乙二胺（PSA）作为吸附剂，以去除提取溶剂中的糖类和蛋白质，因此分别照1.2.5步骤，预处理1.2.6中样品溶液，考察不同种类与用量的吸附剂对基质效应的影响，结果见图4。

图4 吸附剂对基质效应的影响Fig.4 The effect of adsorbent on matrix effect

从图4可知，当吸附剂为PSA时，样品基质对合成色素检测时干扰较小，7种色素的平均基质效应为5%左右，而C18相对较高，可能归因于对部分色素具有一定吸附作用，另外随着PSA用量的增多，平均基质效应降低并不明显，因此选择100 mg PSA作为QuEChERS法预处理的吸附剂。

2.6 不同预处理方法结果的准确度与精密度

为考察3种预处理方法结果的准确度与精密度，采用回收率表示结果准确度，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示结果的精密度，分别照1.2.3、1.2.4和1.2.5所述步骤，预处理3个水平（0.50、1.0、5.0 μg/mL）的加标样品，进行回收试验，每个水平平行测定5次，结果见表3。

表3 不同预处理方法的测定结果回收率与相对标准偏差（n=5）Table 3 The average recoveries and RSDs of results in different pretreatment methods（n=5）

从表3可知，SPE法的不同浓度水平的平均回收率在70%～110%之间，而QuEChERS法与LLE-GPC法的不同浓度水平的平均回收率均在90%～110%之间，优于SPE法，这可能归因于提取溶液在固相萃取时，未被完全洗脱，3种方法的相对标准偏差均低于5%。与LLE-GPC法、SPE法相比，QuEChERS法的提取、除杂、纯化过程简便、快速，且无需昂贵的仪器与耗材，因而综合预处理效率较高，适于相关产品的快速检测。

3 结论

采用液液萃取-凝胶渗透色谱法、固相萃取法和QuEChERS法预处理腌制肉类食品后，利用高效液相色谱-质谱法同时测定其合成色素的含量，固相萃取法的不同浓度水平的平均回收率在80%～110%之间，而QuEChERS法与液液萃取-凝胶渗透色谱法的不同浓度水平的平均回收率均在90%～110%之间。与液液萃取-凝胶渗透色谱法、固相萃取法相较，QuEChERS法预处理样品的操作更为简便、快速，且处理成本适中，综合预处理效率较高，因此适用于腌制肉类食品中合成色素的测定。