基于琥珀酸二钠的鲜味相互作用及呈味基料的研究

马杰，周希瑞，魏轩，陈艳萍，陈高乐，刘源

（上海交通大学农业与生物学院，上海200240）

基本味觉包括酸、甜、苦、咸、鲜5种，其中鲜味作为第5种基本味觉，是由鲜味物质与受体结合产生的味觉感受[1-2]。根据化学结构的差异性，鲜味物质可分为氨基酸及其盐类、核苷酸类、有机酸类、肽类等[3-4]。琥珀酸及其钠盐作为有机酸类，被认定属于鲜味物质[5]。琥珀酸二钠（disodium succinate，WSA）俗称干贝素，呈鲜阈值为0.03%[6]，是贝类、虾、蟹等海产品及香菇中的重要鲜味物质[7-8]，是我国食品添加剂国家标准唯一批准使用的有机酸类鲜味物质[9]。食品中富含种类不同的鲜味物质，它们均可引发鲜味，肉类、鱼类等食物以及调味品呈现的特殊鲜美滋味是多种鲜味物质相互作用的结果。

关于鲜味物质相互作用的研究多集中在氨基酸类和核苷酸类之间，主要是谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）与肌苷酸二钠（inosinate monophos－phate disodium salt，IMP）、鸟苷酸二钠（guanosine monophosphate disodium salt，GMP）的相互作用。针对有机酸类鲜味物质与其他鲜味物质的相互作用研究较少，且相互作用的研究多以食物为研究对象，仅从滋味对食物整体贡献度方面进行了解释，并没有对鲜味物质之间的相互作用规律进行深入研究。另一方面，近年来，养殖暗纹东方鲀在加工过程中会产生大量的副产物如鱼头、鱼骨等，这些副产物可以酶解后进行美拉德反应制备呈味基料。因此，这些河鲀鱼副产物可以作为呈味基料的原材料而被充分利用，从而提高其经济附加值。

针对鲜味物质相互作用的定量研究，感官评定是最直接、有效的方法，其中，两点强迫选择性检验法（2-alternative forced choice，2-AFC）培训过程相对简单，且已被广泛用于甜味强度的定量研究。时间-强度法（time intensity，TI）作为一种动态感官方法，能够有效反映滋味物质的感官属性在口腔中的动态变化[10-11]。基于此，本试验拟采用WSA为研究对象，利用感官试验中的2-AFC法和动态感官TI法对WSA与市面上常用的鲜味剂呈味核苷酸二钠（disodium ribonucleotide，I+G）、酵母抽提物（yeast extract，YE）相互作用的规律进行研究，并且结合相互作用规律开发基于河鲀鱼副产物的新型呈味基料。该研究可为其他二元鲜味物质互作及新型鲜味剂开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

琥珀酸二钠（纯度＞98.0%）、肌苷酸二钠（纯度为98.0%）：上海柯灵斯试剂有限公司；鸟苷酸二钠（纯度为98.0%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；I+G为GMP和IMP按照1∶1（质量比）混合得到；酵母抽提物0203型（基础型，鲜味一般，主要为厚味）：思宾格公司；复合蛋白酶（食品级，活性≥90 U/mg，St.Louis，MO，USA）：Sigma Chemicals；D-（+）-木糖（BR，≥98.5%）、L-半胱氨酸（≥98.5%，BR）：国药化学试剂有限公司。养殖暗纹东方鲀（2年，每条鱼质量约为200 g～300 g）：大连天正实业有限公司；试验用水均为Milli-Q系统制备的超纯水；所有样品均控制在室温条件（23±2）℃。

1.2 仪器与设备

IKA-A11BS025分析研磨机、T-25高速分散机：德国IKA公司；真空冷冻干燥机-Alpha 1-2 LDplus：德国Christ公司；马尔文Kinexus旋转流变仪-Ultra+：英国马尔文仪器有限公司。

1.3 琥珀酸二钠与呈味核苷酸二钠（I+G）和酵母抽提物（YE）相互作用研究

1.3.1 专业感官员筛选与培训

根据“ISO 8586：2012 Sensory analysis-General guidelines for the selection，training and monitoring of selected assessors and expert sensory assessors”的标准，从上海交通大学招募了60名志愿者。最终经过筛选和培训，建立了稳定在24人的感官评价小组（15名女性和9名男性，年龄在21岁～36岁之间）。

参考“ISO-5495：2005 Sensory analysis-Methodology-Paired comparison test”的标准，对24名感官员进行2-AFC培训。时间-强度法参考ASTM E1909-13（2017）《Standard Guide for Time-Intensity Evaluation of Sensory Attributes》[12]，试验中的鲜味强度值通过标准化设计的坐标轴纸进行收集，坐标横轴代表时间（s），纵轴代表鲜味强度标度值，以长度单位（mm）表示。计时过程由试验员统一进行。

1.3.2 基于2-AFC的琥珀酸二钠与I+G和YE相互作用探究

在该试验阶段使用样品为WSA与I+G混合溶液、WSA与YE混合溶液。WSA浓度为0.35%（该浓度能提供适中鲜味），YE则为5个浓度梯度（0.005%、0.05%、0.5%、1%、2%）；同样，I+G也设置5个浓度梯度（0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%）分别与 WSA（0.35%）进行复配。选用24名经过培训的专业感官员，向他们每次提供3对样品。每对样品由复配溶液和一个MSG溶液（10 mL）组成，每对样品以平衡随机顺序呈现给感官员。对于每对样品，感官员需要根据感知到的鲜味强度选出鲜味较强的样品并记下编码。样品与样品品尝之间，感官员需要用超纯水充分漱口2次～3次，并休息2 min。

1.3.3 基于时间-强度法（TI）的琥珀酸二钠与I+G和YE相互作用探究

选用8名经过培训的专业感官员，基于1.3.2中的试验结果选用WSA∶I+G=0.35% ∶0.4%、WSA∶YE=0.35% ∶0.5%的复配溶液及 WSA（0.35%）、（I+G）（0.4%）、YE（0.5%）单一溶液作为待测样品。在试验员计时口令发出时（0 s），感官员立即品尝样品并充分感受其鲜味，随后在5、10、20、30、45、50、60、70、80、90、100 s指令发出时，分别在坐标纸上标出感受到的鲜味强度值，其中40 s指令发出时立即将样品吐出，之后感官员对口腔中残留的鲜味进行打分。样品与样品之间至少休息2 min，并用超纯水充分漱口2次～3次，每个样品重复测定3次[13-14]。

1.4 呈味基料制备与特性测定

1.4.1 河鲀鱼副产物制备

根据SC/T 3033-2016《养殖暗纹东方鲀鲜、冻品加工操作规范》对暗纹东方鲀进行处理，收集鱼头和鱼骨放于-80℃冰箱贮存备用。为了使河鲀内源酶失活，将收集的副产物放于烧杯中在85℃循环水浴下煮制20 min，冷却至室温（23±2）℃后，将鱼头、鱼骨使用研磨机对其进行粉碎处理。将粉碎后的样品包装在铝箔袋并于-20℃下储存备用[15]。

1.4.2 蛋白水解物制备

在复合蛋白酶水解之前，将收集的河鲀鱼副产物在4℃冰箱中过夜解冻14 h。按照超纯水与河鲀副产物粉末样品4∶1（质量比）的比例加水溶解。为了更充分溶解，通过T-25高速分散机进行匀浆处理。复合蛋白酶水解条件为47.7℃[16]，pH 6.1（使用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl进行调节）5 h[超纯水∶副产物∶复合蛋白酶=400∶100∶2.6（质量比）]。然后，将得到的酶水解产物在95℃下灭活15 min。将产物冷却至室温（23±2）℃，随后在25℃下，对酶水解产物进行15min7000g离心，收集上清液。冷冻干燥所得清液，收集河鲀鱼复合蛋白酶解物粉末（takifugu obscurus by-products protein hydrolysate，TBPH）并将其储存在-20 ℃冰箱备用[16-17]。

1.4.3 美拉德反应产物（Maillard reaction products，MRPs）的制备

美拉德反应产物的制备参考Wang等[18-20]的方法。制备10 mL反应体系（TBPH0.5 g、木糖0.2 g、半胱氨酸0.15 g、纯水10 mL）于试管中，然后将样品在pH 7.4，120℃金属浴下加热2 h进行美拉德反应，冷却至室温（23±2）℃。然后真空冷冻干燥收集粉末并称重，将美拉德反应产物粉末（MRPs）储存在-20℃冰箱备用。

1.4.4 美拉德反应产物（MRPs）适宜浓度的选取

6名已培训过的专业感官员进行该步骤的感官试验。为了使MRPs鲜味更好地体现，需要选取适当的鲜味基质溶液，参照Ogasawara等[19]的研究结果，选择MSG-NaCl（0.3%∶0.1%）作为基质溶液的最佳比例。配置浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的MRPs溶液于基质溶液中，要求感官员对其进行鲜味强度打分。鲜味强度打分在100 mm的坐标轴纸上进行收集[21]，标度最左端定义为“感受不到鲜味”，标度最右端定义为“鲜味极其强烈”。每个样品重复测定3次。

1.4.5 一元/二元鲜味物质与美拉德反应产物（MRPs）混合溶液鲜味强度测定

根据1.4.4的试验结果，选用0.1%MRPs与NaCl（0.3%）以体积比1∶1混合，作为该步骤中混合溶液的基质溶液。在基质溶液中分别加入WSA∶I+G（0.35%∶0.4%）和 WSA ∶YE（0.35% ∶0.5%）两个二元相互作用组合，以及0.3%MSG，以检测WSA、I+G和YE，以及MSG对MRPs混合溶液的鲜味提升作用。

使用10名已培训过的专业感官员对混合溶液进行鲜味强度打分。其他感官评定的步骤同1.4.4。

1.4.6 美拉德反应产物（MRPs）混合溶液的流变特性测定

流变特性的测定利用马尔文Kinexus旋转流变仪-Ultra+，以黏度为测定指标。选用以圆筒为夹具的流变仪测定混合溶液样品的黏度，圆筒尺寸为PC14 C0009 SS。测定时的剪切速率设定为（0.1 s-1～50 s-1）。测量前样品先平衡静置5 min，选用稳态扫描模式，温度为25℃，设定变量每增加10倍取5个点，每个样品做两次平行[22]。

1.5 数据分析

对于2-AFC试验的结果，感官员的选择率表示为“谷氨酸钠样品更鲜”的人所占的百分比。通过选择率对谷氨酸钠浓度作图，线性回归拟合直线用于确定50%选择率对应的MSG浓度，这被认为是该样品的相对鲜味强度[23]。

时间-强度数据结果使用每一个时间节点下的强度分值的平均值表示。数据显著性采用SPSS（IBM SPSS Statistics 24）分析。针对TI特征参数——最大强度Tmax，采取单因子方差分析（One-Way ANOVA）。

混合溶液鲜味强度的分值测定用每一个混合样品浓度下感官员3次测量的平均值表示，整体数据显著性采用SPSS（IBM SPSS Statistics24）进行分析（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 基于2-AFC的琥珀酸二钠与I+G鲜味相互作用结果

不同混合溶液在特定浓度下的拟合曲线见图1。

由图1可知，各拟合曲线50%选择率对应的MSG浓度即为该样品的相对鲜味强度。计算结果见表1。

由表1可知，混合溶液的相对鲜味强度先增大后减小。在I+G浓度为0.4%时，混合溶液的相对鲜味强度达到最大，为0.520%MSG。推测是在该浓度下，呈味核苷酸二钠解离出足够多的Na+与WSA产生了相互作用，最大程度地增强了鲜味，这与鲜味的产生机理是一致的，即鲜味的发挥需要一定量的Na+包围阴离子[4]。而当I+G超过一定浓度时，鲜味强度下降可能是由于IMP浓度过高时，本身所产生的涩味对鲜味强度有抑制作用，这与陈继兰等[24]的研究结果一致。

图1 WSA和I+G混合溶液相对鲜味强度拟合曲线Fig.1 Relative umami intensity curve of WSA and I+G mixed solution

表1 I+G与WSA复配后相对鲜味强度测定Table 1 Relative umami intensity of mixed I+G and WSA

2.2 基于2-AFC的琥珀酸二钠与YE鲜味相互作用结果

WSA与不同浓度YE混合的拟合曲线见图2。

图2 WSA和YE混合溶液相对鲜味强度Fig.2 Relative umami intensity curve of WSA and YE mixed solution

由图2可知，各拟合曲线50%选择率对应的MSG浓度即为该混合溶液的相对鲜味强度。计算结果见表2。

表2 YE与WSA复配后相对鲜味强度测定Table 2 Relative Umami intensity of mixed solutions with YE and WSA

由表2可知，混合溶液的鲜味强度逐渐增大，但当YE超过0.5%时，相对鲜味强度基本维持在0.3%MSG左右，并且混合溶液出现了酸味和涩味而不被感官员所接受，这与刘建彬等[25]的研究一致。此外，刘通讯等[26]研究发现，当YE添加浓度为0.2%时，对酱油鲜味改善不明显，当添加浓度0.5%、0.8%、1.0%均能较好地改善酱油风味，但整体差距不大。

由表2滋味描述结果可知，WSA与YE混合溶液达到较强的鲜味强度且不致产生酸、涩味的浓度为0.35%∶0.5%。YE本身就是一种复杂的体系，富含多种氨基酸，微量元素及谷胱甘肽、鸟苷、肌苷等[27]，本文的研究把YE看作一元鲜味物质，相对WSA与I+G的混合溶液，该混合溶液并没有对鲜味有较大的提升，这可能与YE本身较弱的鲜味有关，由于YE体系的复杂性，其本身含有的其他物质可能对鲜味感知有影响。

2.3 基于时间-强度法（TI）的琥珀酸二钠与I+G和YE鲜味相互作用结果

二元混合溶液及单一组分溶液的时间-鲜味强度曲线见图3。

由图3可知，在0～100 s计时范围内，7个样品表现出相似的时间特性，即在0～5 s内，鲜味强度逐渐增大，在5 s左右达到最大鲜味强度，然后5 s～100 s内，鲜味强度逐渐降低。这与Giovanni等[28]的研究结果一致，即0 s至200 s内，鲜味强度因在口腔中被感知而增大，后因溶液被吞咽或者被吐出，鲜味逐渐减弱。

对时间强度曲线中的特征参数（最大鲜味强度）提取分析，各样品时间强度曲线中最大鲜味强度如图4所示。

由图4可知，样品对最大鲜味强度有显著性影响（p＜0.000 1）。0.35%WSA与0.4%I+G的混合溶液呈现最强鲜度，且比单一0.4%I+G、0.5%YE、0.35%WSA鲜味强（相对应的 p＜0.000 1，p＜0.000 1，p＜0.00 1），这与之前2-AFC的鲜味强度结果一致。由图3可知，在吐前（0～30 s）和吐后（45 s～100 s）鲜味在不同样品中呈现不同的趋势。因此，分别对吐前和吐后溶液鲜味强度变化进行分析，混合溶液及单一溶液吐前、吐后TI曲线如图5和图6所示。

图5 WSA和I+G混合溶液及单一溶液TI曲线图Fig.5 TI curve of WSA and I+G mixed solution and single solution

由图 5可知，在吐前（0～30 s），0.35%WSA 与 0.4%I+G的混合溶液鲜味强度显著比单一WSA强（p=0.012），且比单一I+G强（p=0.014）。这说明它们之间对鲜味的影响作用具有双向性，即往0.35%WSA中加入0.4%I+G，可以增强0.35%WSA的鲜味强度，0.35%WSA的加入同样可以增强0.4%I+G的鲜味。在溶液吐出之后（45 s～100 s），WSA与I+G的混合溶液鲜味强度显著比单一WSA强（p=0.014），但混合溶液的鲜味与单一I+G所引起的鲜味没有差异（p=0.73），即吐后，它们对口腔中残留鲜味强度的相互作用具有一定方向性。

图6 WSA和YE混合溶液及单一溶液TI曲线图Fig.6 TI curve of WSA and YE mixed solution and single solution

综合上述结果可以发现，WSA和I+G对即时鲜味强度和残留鲜味强度是有不同影响的。文献表明I+G作为核苷酸类鲜味物质，在鲜味上具有直冲感和先觉感，而WSA可以将食品的先觉感和后觉感连在一起[6]，它们的结合不仅增强品尝时的鲜味，且对残留鲜味也有增强效果。阎微等[29]发现IMP、GMP在不同食品体系中的增鲜效果不同，IMP在增鲜及适口性上具有较好效果，而GMP在增鲜及滞留感上具有较好效果，这一结果与本文研究结果一致。

同样针对0.35%WSA与0.5%YE的混合溶液以及单一溶液进行吐前和吐后鲜味强度变化分析。由图6可知，在吐前（0～30 s），WSA 与 YE 混合溶液的鲜味强度比单一YE强（p=0.018），但与单一WSA溶液之间没有差异（p=1.00）。这说明YE的加入不能增强WSA的鲜味强度。在吐后（45 s～100 s），样品之间在残留鲜味强度上没有差异（p=0.57），即对于残留鲜味强度，WSA与YE之间并没有显著的相互作用。

2.4 美拉德反应产物（MRPs）适宜浓度的选取结果

在0.3%MSG+0.1%NaCl的基质溶液中，加入不同量的MRPs以检测其对鲜味强度的影响。不同浓度下MRPs对应的鲜味强度见图7，结果显示MRPs浓度对混合溶液鲜味强度有显著影响（p=0.013）。

由图7可知，鲜味强度随着MRPs的浓度升高（0.1%～0.5%）而变强，且呈现良好线性关系（R2=0.967 3）。且0.1%MRPs的鲜味强度分值为50左右，表现出适宜的鲜味强度，据此，后续鲜味评定试验采用0.1%MRPs浓度。

图7 不同浓度下美拉德反应产物（MRPs）的鲜味强度Fig.7 Umami intensity perceived from different concentrations of MRPs

2.5 一元/二元鲜味物质与美拉德反应产物（MRPs）混合溶液鲜味强度测定结果

0.1%MRPs与一元或二元鲜味物质的混合溶液鲜味强度测定结果如图8所示，其中对照组为0.1%MRPs+0.1%NaCl（即基质溶液）。

图8 不同鲜味物质对美拉德反应产物（MPRs）鲜味的影响Fig.8 The influence of different umami substantces on enhancing MPRs umami taste perception

图8表明，样品之间的鲜味强度有显著性差异（p＜0.000 1），添加了WSA与I+G的混合溶液呈现最强鲜味，且显著的比0.3%MSG的混合溶液和基质溶液鲜味强（相对应的p＜0.000 1，p＜0.000 1）。Wang等[18]对河鲀鱼肌肉酶解物美拉德反应的研究表明，3个不同级分肽段得到的MRPs相比于空白对照组在鲜味、浓厚味、可接受性方面均有提高。Yang等[16]测定了河鲀副产物酶解物的游离氨基酸含量，结果表明，相比于未经过酶解处理的对照组（267.49 mg/100 g），酶解物具有更高的游离氨基酸（1 733.19 mg/100 g）。据此可以推断，MRPs对鲜味的提升，可能是由于该产物本身的滋味、特征香气、理化特性的综合影响；也有可能WSA与I+G混合溶液的加入对MRPs的鲜味有显著性提升，并且该提升相比于其他混合溶液是最大的。然而，与MSG相比WSA与YE的混合并没有带来鲜味的显著提升（p=1.00）。

2.6 美拉德反应产物（MRPs）混合液体的流变特性测定结果

研究表明浓稠度的增大会改变食品的质构从而影响滋味物质在口腔中的释放，进而影响滋味呈味[30-31]。针对上述不同MRPs混合溶液所产生的不同鲜味强度，对样品的黏度特性进行了测定。各混合溶液黏度测定结果见图9。

由图9可知，随着剪切速率的增加，混合溶液展示出剪切稀化特性。数据分析表明，不同样品的黏稠度在不同剪切速率下没有差异（p=0.46）。其中0.1%MRPs的混合溶液和0.5%MRPs的混合溶液之间没有差异，表明MRPs的加入量不会对黏稠度造成影响，因此不同浓度MRPs对鲜味强度的影响不是由流变特性导致，是由于MRPs本身香气和鲜味物质导致的。

图9 MRPs不同混合溶液黏度Fig.9 Viscosity of different mixed solutions of MRPs

3 结论

本试验以琥珀酸二钠（WSA）为研究对象，通过2-AFC法对WSA与I+G和YE二元相互作用进行鲜味强度定量探究，并通过TI法，对这些混合溶液的二元相互作用进行鲜味动态变化研究。结果表明WSA与I+G在0.35%∶0.4%浓度比例下，表现出最强鲜味。WSA与YE在0.35%∶0.5%比例下表现出较高的鲜味强度。在动态感官试验中，I+G的加入可以显著增强WSA的鲜味强度。该试验将静态感官与动态感官相结合，对鲜味物质二元相互作用下的即时鲜味和残留鲜味进行分析，全面研究了WSA与YE及I+G的二元呈鲜作用。

此外，结合团队前期研究的成果，制备河鲀副产物酶解物的美拉德反应产物（MRPs），发现MRPs本身可以提升鲜味，并且其他鲜味物质的加入会显著提升MRPs的鲜味，MRPs∶WSA ∶I+G=0.1% ∶0.35% ∶0.4%可作为制备呈味基料的配方。该试验针对以MRPs为主的呈味基料进行了初步研究和开发，可为制备鲜味呈味基料，开发新型增鲜剂提供理论依据。