宫腔微生物与辅助生殖妊娠结局的相关性分析

张倩，王瑶，张宁，陈霞慧，赵梦思，于月新

(北部战区总医院生殖医学中心，沈阳 110016)

近年来我国不孕症人数呈现逐年递增趋势，其发病机制复杂且病因多样化。辅助生殖技术 (ART) 已成为解决大部分不孕患者生育问题的治疗方法，女性生殖道微生物与ART妊娠结局的关系也日益受到人们的关注。女性生殖道微生态系统是由多种微生物群组成的独特的动态体系。长期以来，女性生殖道微生态主要集中在对阴道的研究。女性阴道中的微生物在阴道卫生、性生活频率等方面的影响下，其构成也在发生着变化，菌群失调和致病微生物感染可能对生育及分娩产生影响[1-2]。有研究推测生殖道微生态的异常可能与不良妊娠结局，如植入失败、自然流产及早产等有一定相关性[3-4]，但目前对生殖道微生态进行分析的研究还很少。

随着实验室检测技术的进步，研究者开始对宫颈、宫腔、卵泡液等多方面进行微生态的检测，推翻了子宫腔内是无菌的传统理念，并证实宫腔内有微生物的存在，且宫腔内微生物的构成对生育力有一定的影响。本研究通过使用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)，对接受ART助孕治疗的女性患者宫腔菌群进行分析，并探讨宫腔微生态改变与妊娠结局的关系。

材料与方法

一、研究对象

以2019年10～12月在我院生殖医学中心行体外受精/卵胞浆内单精子注射(IVF/ICSI)治疗并接受冻融胚胎移植(FET)的不孕患者为研究对象。

纳入标准：(1)年龄<40岁；(2)移植胚胎中至少包括1枚形态学评分优质胚胎(7～9细胞I级D3胚胎或3BB以上的D5囊胚)；(3)无粘膜下肌瘤或内膜息肉等宫腔占位性病变者。排除标准：(1)移植困难者；(2)输卵管积水没有处理或处理后仍复发；(3)中重度子宫内膜异位症；(4)抗磷脂综合征等免疫性疾病、甲状腺功能异常、严重系统性疾病；(5)薄型子宫内膜(子宫内膜厚度<5.0 mm)以及胚胎移植术前7 d内查阴道分泌物提示分泌物异常者。本研究共纳入238个周期。本研究经我院伦理委员会审查批准，研究对象均签署知情同意书(批件号：202H2019PJ005)。

二、研究方法

1.子宫内膜准备方案：根据月经周期是否规律主要分为自然周期和人工周期。(1)自然周期方案。对于月经周期规律、排卵正常患者，采用自然周期方案，在月经周期的第8～10天开始进行超声评估，当优势卵泡的直径为16～20 mm时，抽取外周血检测孕酮及促黄体生成素(LH)水平，如果没有排卵，则取消周期。(2)人工周期方案。在月经周期第2～4天开始口服补佳乐(拜耳，德国)，初始用量为从第1～8天为4 mg/d，第9～12天调整为6 mg/d，并可根据内膜厚度调整补佳乐剂量，当子宫内膜厚度达到6.0 mm或更多且无优势卵泡生长时，肌肉注射黄体酮注射液(浙江仙琚)40 mg/d，口服孕激素(黄体酮胶囊，浙江仙琚)200 mg/d进行内膜转化并纳入本研究。

2.样本采集及菌群培养鉴定：按照规范[5]进行胚胎移植操作后，对胚胎移植导管的内管尖端进行细菌培养，以分离培养出可能存在的细菌。胚胎移植时注意避免移植导管内管与阴道壁及宫颈的接触。在5% CO2、37℃有氧和厌氧环境下分别用巧克力琼脂培养基(不含抗生素)(郑州安图生物工程股份有限公司)和血琼脂培养基(郑州安图生物工程股份有限公司)培养导管尖端的菌株，培养48～72 h。本研究培养微生物不包括衣原体和支原体。

3.菌落鉴定：采用MALDI-TOF(bruker microflex maldi-tof MS，布鲁克，德国)及其相关配套软件进行宫腔菌群培养的分析鉴定，标本制备、上机检测及结果分析参照相关鉴定操作流程和标准化操作专家共识[6]。

4.妊娠结局判定：胚胎移植14 d之后，血HCG≥50 U/L为HCG阳性；HCG阳性者于移植后4周行超声检查，子宫腔内见孕囊和原始心管搏动为临床妊娠。

5.观察指标：记录研究对象的一般资料、胚胎移植情况及临床妊娠率，临床妊娠率=临床妊娠周期数/总周期数×100%。

6.分组：根据质谱鉴定结果并按宫腔内微生物是否以乳杆菌为主要菌群分成3组，即只含乳杆菌的为乳杆菌主导组(n=122)、未检测出细菌的为检测阴性组(n=40)和同时含乳杆菌与非乳杆菌为非乳杆菌组(n=76)。

三、统计学分析

结 果

一、菌群培养结果

质谱鉴定结果显示，检出细菌的移植周期占总移植周期的83.19%(198/238)，在菌属水平上，宫腔内检出的乳杆菌属占检出菌属总体的57.34%，非乳杆菌属包括链球菌属、棒杆菌属、葡萄球菌属、加德纳菌属和肠球菌属(表1)。

表1 宫腔菌群在菌属水平的分布情况(%)

二、3组患者的一般资料比较

3组患者的年龄、配偶年龄、体重指数(BMI)、不孕年限、不孕类型、不孕因素、基础FSH、子宫内膜厚度及FET内膜准备方案等比较均无显著性差异(P>0.05)；乳杆菌主导组和非乳杆菌组中的抗苗勒氏管激素(AMH)均显著低于检测阴性组(P<0.05)，而乳杆菌主导组与非乳杆菌组比较无显著性差异(P>0.05)(表2)。

三、3组患者移植情况及妊娠率比较

3组患者的移植胚胎类型及移植胚胎数比较均无显著性差异(P>0.05)；乳酸杆菌主导组患者的临床妊娠率显著高于非乳杆菌组(P<0.01)，而检测阴性组与非乳杆菌组比较无显著性差异(P>0.05)(表3)。

四、宫腔内菌群与临床妊娠结局的关系

单因素分析结果显示，宫腔内菌群分布差异对临床妊娠率有显著影响(P<0.05)，而不孕年限、BMI和不孕类型等对妊娠结局均无显著影响(P>0.05)(表4)。

表2 三组患者的一般资料比较[(-±s)，n(%)]

表3 三组患者移植情况及妊娠比较n(%)

表4 临床妊娠结局的单因素分析

采用多因素Logistic回归分析宫腔内菌群对妊娠率的影响，显示当宫腔内菌群为非乳杆菌时可以使临床妊娠率显著降低84%[OR=0.16，95%CI=(0.06，0.39)，P<0.05]，在调整女方年龄、基础FSH、AMH和移植胚胎数等混杂因素后，宫内菌群仍是影响妊娠结局的独立危险因素87%[OR=0.13，95%CI=(0.04，0.38)，P<0.01](表5)。

表5 调整相关参数后 Logistic回归分析宫腔内菌群与妊娠率的关系

讨 论

在人类微生物计划 (human microbiome project，HMP) 的推动下，微生物群对人类生殖的重要性越来越被认可[7]。ART成功主要取决于患者年龄、胚胎质量和子宫内膜容受性。随着实验室技术的发展，获得优质胚胎的几率已经大幅度提升，子宫内膜容受性则成为提高辅助生殖结局的新突破口。女性生殖道微生物群可能会影响全身及局部的免疫[6]，从而影响到内膜容受性[9]。女性生殖道微生物已成为近些年的研究热点。

早期由于对微生物鉴定及取样方面的局限性，人们认为宫腔内是无微生物的。但随着技术的发展，利用16s rRNA技术对子宫内膜检测发现了低生物量微生物，从而证实子宫内确实是有菌的[9]。现在对于子宫微生物群的研究越来越多，但主要集中在子宫内的微生物群对后代和新生儿免疫的影响等方面，而子宫内膜菌群对妊娠结局以及对生殖健康的重要性往往被忽视[10]。本研究是使用MALDI-TOF MS进行菌属鉴定，这是近年来在微生物鉴定领域应用发展迅速的一种新型鉴定技术。该技术与16s rRNA测序的方法相比，虽然16s rRNA测序技术可以检测到需要特殊培养的稀有菌属，但其却不能区分活菌或者死菌的细菌碎片。而MALDI-TOF MS则能够检测蛋白质和核酸等生物大分子，鉴定的准确率优于传统的方法，且操作简单、耗时时间较短，整个过程几乎不需要额外的耗材，鉴定花费低，可对临床样本快速诊断，更能满足临床的需求[11]。

目前，病原菌影响胚胎着床的机制尚不清楚。有研究表明微生物群对免疫有影响[12-13]。如果微生物在妊娠前已经影响了子宫的免疫环境，则会极大的影响子宫内膜的接受能力和初始胎盘的正常形成，从而可能会导致不孕或胎盘功能受损。也有学者认为以非乳杆菌为主的微生物群可能会引发子宫内膜炎，从而影响胚胎植入的成功率[14]。此外，人们还需考虑一些直接产生微生物的代谢物和(或酶)相关的作用机制，这些代谢物能够产生相关的复合物，在子宫内膜上皮诱导关键的细胞通路。在胚胎着床期，需要子宫内膜与囊胚之间正确的相互作用，滋养细胞的迁移与血管重构的潜在机制可能与内膜有关，如果微生物及其代谢物在复杂的子宫环境中影响了任何一种生理作用，都可能影响胚胎着床。

Tao等[15]通过评估从70名行IVF-ET患者导管尖端获得的微生物群，检测到大量乳杆菌，其次还有棒杆菌、葡萄球菌、链球菌和双歧杆菌等。Franasiak等[16]通过对33名接受辅助生殖助孕妇女在ART期间胚胎移植导管尖端获得子宫内膜微生物组进行的研究，也证实了乳杆菌是最丰富的菌属。本研究发现接受ART的不孕症女性宫腔内菌群优势菌属主要为乳杆菌属，与上述研究结果一致。在子宫内膜容受期宫腔内菌群的分布与妊娠结局相关性分析中发现。当移植时宫腔内微生态以非乳杆菌为主时妊娠率显著降低(P<0.05)，调整模型中影响临床妊娠率的相关因素后进行多因素Logistic分析发现，未调整和调整模型未显著改变相关结果[OR=0.13，95%CI=(0.04，0.38)，P<0.01]，提示宫腔内菌群为非乳杆菌是影响辅助生殖结局的独立危险因素。这与以往大部分的研究结果是一致的[17-22]。但也有研究者发现以乳杆菌为主的宫腔内环境并不能改善妊娠结局[23]。因此，两者关联性仍需探讨。同时，我们也发现宫腔内检测阴性组妊娠率高于非乳杆菌主导组(65.00% vs 36.84%)，Logistic分析发现，检测阴性组与临床妊娠之间有显著的相关性(P<0.05)，提示即使未检出乳杆菌的存在，妊娠也是有可能的，但次于以乳杆菌为主导组。

综上所述，ART结局受诸多因素影响，宫腔内异常菌群的存在可能影响妊娠结局。其机制尚需深入研究，可为今后不孕症的临床决策提供依据和新思路。