超声处理对组织工程骨支架性能的影响

刘 阳 ，许 燕 ，2，周建平 ，2，张钟毓

（1.新疆大学机械工程学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.西安交通大学机械工程学院，陕西 西安 710049）

1 引言

骨具有强度高，脆性低，硬度大且具有韧性，此外还具备高强度并且有多孔结构的特性，这些矛盾的特性能同时具备，是通过从分子上到宏观可分辨的尺度的多级结构经过共同协同作用实现的结果[1]。目前，骨组织工程作为近年来新兴的骨修复处理方法，在骨科、矫形外科以及口腔外科等众领域进行了广泛探索应用，是进行研究的前沿性课题，在临床及产业化方面具有很好前景。

组织工程目的在于通过采取一系列方式方法将活细胞、营养物质与支架载体比较理想地结合在一起，经过组织工程骨支架材料在生物体内逐渐降解，同时伴随着附着于支架的细胞分化增殖，从而生成出新骨组织。HA 复合材料组织工程骨支架是属于对组织工程支架进行研究探索的热点方向之一[2]。其中，HA 复合丝素蛋白组织工程多孔隙骨支架是HA 复合材料组织工程骨支架的一条重要分支，目前其制备处理方法主要是通过冷冻干燥和高温烧结等加工工艺方式进行强化处理，高温烧结可控性差，且容易产生裂纹，其中普遍存在无法使组织工程骨支架在一定孔隙条件下同时兼有优良韧性和抗压强度的问题，此外支架表面孔隙形貌也一直是研究热点领域。

超声波根据用途可归成检测超声和功率超声两种类型，功率超声主要是利用能量来加工和处理工件[3]。超声波在液体中传播的形式是通过形成一系列压缩波以及稀疏波来进行传播的，其分别相对应地生成一系列正压及负压，并构成有规律地正压与负压交替的周期，能够在液体条件下生成空穴效应，微流束效应，热效应及机械效应[4]。故超声波可通过对液体的作用，不仅仅可以对HA 复合丝素蛋白组织工程骨支架进行表面改性处理，而且还可以改变其内部的组织结构，从而改变其性能。

故针对目前HA 复合丝素蛋白组织工程骨支架无法兼有优良韧性、抗压抗剪切强度和较好支架表面形貌孔隙的问题，而提出一种特殊加工工艺方法—超声波处理法，并进行了实验探究。

2 实验部分

2.1 实验原料与设备

羟基磷灰石（纯度96%，粒径40nm，南京某纳米材料有限公司）；聚乙烯醇（北京某科技有限公司）；丝素蛋白（粒径350nm，湖州新天丝生物技术有限公司）；蒸馏水（pH=6.5～7，河南新源科技有限公司）；HH-1 数显恒温水浴锅（金坛市城某仪器厂）；BCD-301WBD 冰箱（合肥某股份有限公司）；SU8000 扫描电镜（日本某高新技术有限公司）；高精度数字电子秤（浙江某集团有限公司）；超声波分散均匀仪（深圳市某电子有限公司）；X-射线衍射仪（美国某公司）；恒温箱；数显恒温磁力搅拌器实验室90-2 高温型磁力加热搅拌机（常州某仪器制造有限公司）；红外光谱仪（VERTEX-70，德国BRUKER）；微机控制电子万能试验机（WDW-20，方辰仪器设备公司，济南）。

2.2 聚乙烯醇/丝素蛋白复合凝胶的制备

将 SF 粉末与 PVA 晶粒按照（SF：PVA=1：4）混合，并加入蒸馏水，然后将混合悬浊液放在数显恒温磁力搅拌器实验室90-2 高温型磁力加热搅拌机上加热至90℃，持续处理60 min，使两者能够充分混合溶解，制备出SF-PVA 复合凝胶，并放入冰箱低温保存。

2.3 样品的处理与表征

将 SF 粉末制备的 SF-PVA（1：4）复合凝胶与 HA 按照配比为1.5：1 充分混合，利用自行研制的机械式挤出3D 打印装置制备出 3 批相同的 24 个（10×10×4）mm 的正方形组织工程骨支架试验样品，如图1 所示。

图1 组织工程骨支架Fig.1 Tissue Engineering Bone Scaffold

将其平均分成4 组，第一组作为对照组，进行完冷冻干燥处理后进行40℃恒温干燥。第（2～4）组进行完冷冻干燥处理后浸入蒸馏水中，在0℃水浴内，频率在40Hz 下根据不同时间（90s、280s和480s）进行超声波处理，然后放恒温箱调至40℃进行干燥处理。用低倍扫描电镜观察分析PVA/SF/HA 复合材料组织工程支架表面的微观形貌；采用红外光谱仪和X 射线衍射仪分别对材料中组分的变化进行分析研究；采用高倍扫描电镜分析支架内部的颗粒结构；采用微机控制电子万能试验机对所制备支架分别进行压缩实验和剪切实验，分析支架的力学性能变化。

3 结果与讨论

3.1 低倍 SEM 分析

支架表面是细胞与植入支架首先进行接触的部位，故其对于细胞对植入支架的反应效果有重要影响，因此对骨组织工程支架进行表面改性处理，改善表面结构形貌可以提高支架在生物体内的结合程度[5]。研究认为，表面微结构、孔隙及表面粗糙度等对细胞在支架上的粘附、增殖以及分化均有重要的意义，对营养物质的吸附也有重要的影响。因此，在支架表面构造成表面粗糙的多孔隙结构具有重要意义。试验样品的低倍SEM 图，如图2 所示。由图可知，对照组的PVA/SF/HA 复合材料组织工程骨支架表面光滑，粗糙度低基本没有微米孔隙，这不利于细胞和营养物质的附着，通过超声波处理的支架，其表面发生明显变化，表面变得粗糙，并且表面存在较多微米级孔隙，并且随着超声波处理时间的增加，表面孔隙明显增加，这有助于支架表面吸附营养物质和细胞的附着与生长，有利于提高PVA/SF/HA 复合材料组织工程骨支架在体内的整合。

图2 低倍SEM 组织工程骨支架表面孔隙形貌Fig.2 Surface Pore Morphology of Low Power SEM Tissue Engineering Bone Scaffold

3.2 FT-IR 分析

FTIR 谱可以用来观察和检测蛋白质结构中较细微的变化情况，可把这变化归类为其二级结构改变，二级结构通常包含有β-折叠、α-螺旋等较为规则的结构以及各种环形和转角等卷曲无规则类结构等，各种二级结构主要是靠亚胺基上氢原子之间氢键和肽链骨架上羟基上氧原子维系[6]。在此实验中，红外光谱主要是为了表征复合粉体中SF 的存在及存在状态，故截取PVA/SF/HA 复合材料粉末在400～2000cm-1的红外吸收光谱[7]。丝素蛋白的酰胺特征峰与其二级结构之间对应关系是解析红外光谱关键点，对应关系：酰胺I 反应C=0 伸缩振动；酰胺II 反应C-N 伸缩及N-H 变形协同运动；酰胺III 反应C-N 的伸缩振动及N-H 面内变形振动[8]。丝素蛋白的红外光谱特征峰经验值，如表1 所示。

表1 丝素蛋白红外光谱特征峰Tab.1 Characteristic Peaks of the IR Spectrum of Silk Fibroin

为研究不同超声波处理时长对PVA/SF/HA 复合材料骨支架的SF 构象中二级结构影响，本实验先将其碎成粉末状，然后对粉末进行FTIR 测试，如图3 所示。从图可看出在未经超声波处理的PVA/SF/HA 复合材料中，SF 的酰胺I 在1640cm-1处有明显的特征吸收峰，酰胺II 在1516cm-1处表现出较弱不明显的特征吸收峰，PVA/SF/HA 复合材料支架经超声波90s、280s、480s 分别处理后，SF 的酰胺II 在1516cm-1处均出现了明显的特征吸收峰，并且随着时间的长度增加，SF 的酰胺I 和酰胺II 的β-折叠结构的含量均有所增加，这些现象均有助于提高支架材料的稳定性。

图3 组织工程骨支架红外光谱图Fig.3 Infrared Spectrogram of Tissue Engineering Bone Scaffold

3.3 XRD 分析

PVA/SF/HA 组织工程支架XRD 谱图，如图4 所示。由图4知，该复合支架材料主要呈现HA 的特征峰，复合材料HA 的晶相结构已经出现，在图中很难发现SF/PVA 所呈现的特征峰。此外从中可看出，经过超声波处理加工后，HA 各晶面衍射峰的强度均明显提高，各衍射峰未发生偏移现象，且随着超声波时间的增加，可代表 HA 的（211）、（002）与（213）晶面的三个特征峰均呈现增强趋势，故HA 结晶度提高，这均有助于PVA/SF/HA 复合材料组织工程骨支架力学性能的提升。

图4 组织工程骨支架XRD 图谱Fig.4 XRD Atlas of Tissue Engineering Bone Scaffold

3.4 高倍 SEM 分析

PVA/SF/HA 复合材料粒子的SEM 图，如图5 所示。颗粒形貌不仅仅影响复合材料的力学性能，而且影响复合材料的生物降解性能，如棒状结构的纳米粒子更易于被细胞吞噬[9]，由图可知，未经超声波加工处理的粒子形貌为絮状结构，这种结构的力学性能差，经超声波加工处理的粒子形貌为棒状，这有助于提高其力学强度[10]。通过图还可看出，随超声波处理时间增加，棒状颗粒数量越多。

图5 高倍SEM 组织工程骨支架微纳米颗粒形貌Fig.5 Morphology of Micro and Nano Particles in Tissue Engineered Bone Scaffolds of High Power SEM

3.5 压缩性能实验

将4 组方案，每种方案6 个样件，放在微机控制电子万能试验机上进行压缩实验测试，测试环境为室温，压缩速度1mm/min，得出实验数据并用Origin8.5 作出试验力—变形曲线图，如图6 所示。

图6 压缩力-变形曲线Fig.6 Compressive Force Deformation Curve

由图可知，PVA/SF/HA 复合材料组织工程骨支架在承受力的过程中几乎未发生脆性断裂，说明其有优良的韧性，在（0～1500）N 区间内，试验力—变形曲线近似直线，弹性模量公式：

式中：E—弹性模量，MPa；σ—正应力，MPa；ε—应变；F—正应力MPa；A—受力接触面面积 mm2；L—试样高度，mm；ΔL—变形量。

因为试样受力接触面面积和试样高度是定值，故弹性模量是图中试验力—变形曲线的斜率，从图中可以看出，经超声波处理明显提高了支架的弹性模量，支架抵抗变形的能力明显增强，有助于支架孔隙及各方面性能保持稳定。

3.6 剪切性能实验

同理，将4 组方案，每种方案6 个样件，放在微机控制电子万能试验机上，对试样的中间部位进行剪切实验测试，最终将得到的数据用Origin8.5 作图，如图7 所示。由图可知，经超声波处理过的支架抗剪切强度明显改善，此外，在处理时长为280s 时，因支架内部多孔隙结构分布不均，曲线在0.25mm 处出现了局部坍塌，但产生了曲线折返，故未使支架失稳。

图7 剪切力-变形曲线Fig.7 Shear Stress Deformation Curve

4 结论

（1）XRD、FT-IR 和SEM 综合分析结果表明，经过超声波处理的骨支架稳定性明显提高，由力学性能分析结果可知，在固定宏观孔隙下，支架的弹性模量和抗剪切性能明显改善。

（2）经超声波处理的骨支架，支架表面孔隙和形貌有了显著地改善，有利于细胞和营养物质附着在表面，并且随着超声波处理时间的增长，骨支架表面孔隙有明显增加。

（3）在微观结构下，经超声波处理过的HA 的结晶度明显提高，SF 的β-折叠结构明显增强，微观颗粒呈棒状结构，这对后期降解和载药性能的研究都有重要意义。