壮医桉楝双莲方治疗小鼠ACD慢性瘙痒的止痒作用研究

莫嵩杰，谢祥官，黄振飞，韦丽珍，覃水云，黄海月，伍冠一，张 煜，温海成

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

瘙痒是一种令人不愉快、引起强烈搔抓欲望的皮肤感觉，是皮肤病最常见的症状之一，有超过1/3的就诊者会发生这种症状，其中大部分属于慢性[1-2]。瘙痒不仅可加重炎症，而且还会导致睡眠严重缺失，严重影响患者及其家庭的生活质量[3]。壮族地区常年气候潮湿，常见痧、瘴、蛊毒引起的疾病。该地皮肤病大多夹湿，在长期与疾病作斗争的过程中，壮族先民积累了许多治疗皮肤瘙痒症的经验[4]。

按照壮医理论，瘙痒病常因毒邪入侵人体三道两路(水道、气道、谷道、龙路、火路)和皮肤，导致三道两路功能失常而致病。在壮族民间常用壮医桉楝双莲方治疗日常生活中的各类皮肤瘙痒病，通过药浴的方式，以达到改善或治愈皮肤瘙痒病的目的。壮医桉楝双莲方治疗瘙痒病以解毒、畅通龙路火路与疏通气道水道为主，大叶桉、七叶莲都有疏通气道、祛风邪的作用，大叶桉具有消热解毒、收敛生肌、祛风止痒之功效；七叶莲具有除湿毒、活血行气止痛之功效；苦楝皮具有强烈的杀虫疗癣的功效，可治疗由皮肤受虫毒而导致的瘙痒；两面针，壮名又叫入地金牛，有疏通龙路火路的作用，可治疗因邪郁闭于龙路火路，两路受阻而导致皮肤瘙痒的病证；穿心莲，可疏通水道，使导致皮肤瘙痒的毒邪从水道中排出，从而起到治疗皮肤瘙痒的作用[5]。壮医桉楝双莲方通过疏通龙路火路、畅通气道水道，使人体之毒邪祛除于体外，从而发挥治疗疾病的效果。虽然壮医桉楝双莲方在民间使用范围较广，但是其对慢性瘙痒的治疗机理和疗效并不明晰。因此，本研究在壮医基础理论指导下，通过建立变态接触性皮炎(Allergic contact dermatitis，ACD)模型，采用血液检测技术来检测桉楝双莲方干预前后小鼠血液(抗痒物质)成分表达水平变化及瘙痒导致的溃烂皮肤的愈合情况，研究不同剂量的壮医桉楝双莲方对治疗ACD模型小鼠慢性瘙痒的作用，探讨其治疗皮肤瘙痒病的疗效，为桉楝双莲方进一步开发和利用，提供前期研究基础，为今后其在临床上治疗皮肤瘙痒病提供重要的实验依据和参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

雄性ICR小白鼠45只，5～7周龄，体重为(29±4)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(湘) 2016-0002。饲养环境：温度(24±2) ℃，相对湿度50%～70%(RH)，昼夜间歇光照，给予SPF级饲料和纯净水。

1.2 药品与试剂

大叶桉200 g、七叶莲200 g、两面针200 g、穿心莲200 g、苦丁茶200 g、金银花藤200 g、龙胆木200 g、苦楝皮200 g(购置于普通药材铺)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司，生产批号：160444)；丙酮、欧丽薇兰特级初榨橄榄油(生产批号：F20170609)；氯化钠溶液(石家庄四药有限公司，生产批号：1611221902)；2，4-二硝基氟苯(SIGMA-ALDRICH，生产批号：BCBR8143V)；小鼠免疫球蛋白E(IgE)酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特，生产批号：E-EL-M0691c)；小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特，生产批号：E-EL-M0049c)；小鼠白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特，生产批号：E-EL-M0044c)；小鼠白介素1β(IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特，生产批号：E-EL-M0037c)；小鼠白介素4(IL-4)酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特，生产批号：E-EL-M0043c)；小鼠白介素13(IL-13)酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特，生产批号：E-EL-M0727c)组胺(HIS)酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特，生产批号：E-EL-0032c)；小鼠白介素31(IL-31)酶联免疫吸附测定试剂盒(优尔生，生产批号：SEB179Mu)。

1.3 实验仪器与设备

HDR-CX405型数码HD摄录一体机(上海索尼电子有限公司)；SQP型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；YE3B16062移液枪(1 000～5 000 μL )、YE3K149048移液枪(100～1 000 μL)、YE3K145273移液枪(5～50 μL)(大龙兴创仪器(北京)有限公司)；BCD-290W型冰箱(青岛海尔股份有限公司)；C2500-R-230V型微型高速离心机(美国Labnet)；ICV-450型电热恒温培养箱(日本ASONE)；MuLtiskan MK3型全自动酶标仪(Thermo scientific)。

1.4 小鼠ACD模型建立

参照文献[6]的方法建立小鼠ACD模型。48只ICR小鼠适应性饲养1周后，随机分为6组，分别为空白对照组、造模组(0.2% DNFB)、壮医桉楝双莲方低剂量组、壮医桉楝双莲方中剂量组(20 mg/kg)、壮医桉楝双莲方高剂量组(50 mg/kg)、阳性对照组(地塞米松，5 mg/mL)，每组各8只。除空白对照组外，其他组实验前5天剃除颈背部毛发(面积约为3 cm×3 cm)，剃除小鼠腹部毛发(面积约为4 cm×4 cm)，使皮肤完全暴露出来。提前3天对小鼠腹部皮肤给予0.5%DNFB(丙酮∶橄榄油4∶1稀释)，给药量为100 μL/只。第0天对小鼠颈部剃毛部位给予0.2%DNFB(丙酮∶橄榄油按4∶1稀释)，给药量为100 μL/只，之后每周用0.2%DNFB进行3次颈部皮肤的敏化(具体敏化时间见图1)给药量为100 μL/只。空白组不予用药，造模组仅致敏给药，给药量为100 μL/只，每周3次进行皮肤敏化；其余4组在需要进行敏化的当天，上午7点进行相应的药物治疗，下午5点进行0.2% DNFB皮肤敏化，除开致敏的天数，其余每天均按时进行相应的药物治疗给药，直至实验结束，实验共进行25天。

1.5 检测指标和方法

1.5.1 小鼠瘙痒行为学观察 通过小鼠的搔抓行为对比来评价瘙痒的严重程度。小鼠瘙痒行为学录制在给予小鼠腹部0.5%DNFB敏化后1天开始进行(即实验的第1、4、11、19、24天)(实验进程见图1)提前5 min将小鼠放进亚克力板方形的透明盒子里适应环境，15 min后在安静、无干扰的环境中持续拍摄小鼠1 h，由不知情人员对回放录像中每只小鼠的搔抓次数进行统计。一次搔抓是指小鼠的后爪抓挠颈部药物的部位的一次或多次动作，当后爪落在地上或被舔和咬，就代表一次搔抓的结束。小鼠前肢运动和前爪、耳、腹划伤均无统计学差异。

图1 实验进程

1.5.2 瘙痒相关细胞因子检测 通过眼球提取获得小鼠全血，离心保存，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测小鼠血清中IgE、TFNα、IL13、IL31浓度水平的变化。

1.5.3 统计学方法 所有实验数据均采用柱状图和折线图的形式，以(mean±SEM，N=x)表示，采用GraphPad Prism软件进行相关数据分析，根据数据类型分别采用单因素方差分析，组间比较行t检验。

2 实验结果

2.1 ACD模型小鼠的皮肤观察

在每次给予小鼠DNFB刺激前，按照评分标准(评分标准见表 1)，对小鼠的皮肤情况一一进行评分。实验第14天进行皮肤评分(评分标准见图2)，结果显示：不同剂量的壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠皮肤的影响程度不同。空白组小鼠皮肤光滑平整毛顺，造模组小鼠皮肤溃烂明显(图4.B/图3.B)，高剂量壮医桉楝双莲方组小鼠皮肤基本无损伤(图4.F/图3.F)，高剂量壮医桉楝双莲方减轻皮肤溃烂效果相对较好；而低(图4.D/图3.D )、中(图4.E/图3.E)剂量组和阳性对照组小鼠(图4.C/图3.C)基本已经有了结痂，但小鼠皮肤受损及溃烂程度相对造模组小鼠来说较轻；壮医桉楝双莲方高剂量组小鼠皮肤受损及溃烂程度与阳性对照组相比较(参考图3/图4，图4为图3完整图)，皮肤受损情况无明显差异。造模组(0.000±0.000，N=7)，壮医桉楝双莲方低剂量组(1.125±0.109，N=8)，壮医桉楝双莲中剂量组(1.857±0.484，N=7)，壮医桉楝双莲方高剂量组(1.500±0.490，N=6)，及阳性对照组(0.188±0.333，N=6)，造模组与壮医桉楝双莲方中、高剂量组，有显著差异(P<0.01)；造模组与阳性对照组比较，无统计学差异(P>0.05)；壮医桉楝双莲方低、中、高剂量组与阳性对照组比较，均无统计学差异(P>0.05)(见图5、图6)。

表1 评分标准

图2 评分标准

图3 不同组别小鼠皮肤损伤情况

图4 不同组别小鼠皮肤损伤情况(为图3完整图)

图5 不同小组小鼠皮肤溃烂程度评分

图6 实验室第14天各组小鼠皮肤评分

2.2 ACD模型小鼠的行为学观察

接触性皮炎的一个重要临床症状是自发慢性瘙痒，为了对皮肤的瘙痒程度进行量化，我们使用小鼠的后爪刮擦剃毛部位的次数作为判断瘙痒程度的指标。观察ACD模型小鼠慢性瘙痒行为，我们发现与空白对照组相比，造模组小鼠瘙痒行为的数量显著增加(P<0.01)。壮医桉楝双莲方中、高剂量组分别与造模组比较，有显著性差异(P<0.05)；壮医桉楝双莲方低剂量组与造模组相比较，结果无统计学差异(P>0.05)。实验结果表明：壮医桉楝双莲方可以减轻受到药物刺激的小鼠的慢性瘙痒行为，但是不明显，仅有壮医桉楝双莲方低剂量组的效果较为明显，而壮医桉楝双莲方中、高剂量组无明显效果，壮医桉楝双莲方组与阳性对照组相比较，低剂量组抑制瘙痒的效果比地塞米松作用强。见表2。

表2 不同剂量壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠慢性瘙痒的影响

2.3 小鼠血清瘙痒相关因子浓度水平变化

本研究将壮医桉楝双莲方低、中、高剂量组与造模组进行比较，结果发现，小鼠血清中抗炎症因子IgE、TFN-α、IL-13、IL-31表达量无明显降低(P>0.05)，阳性对照组与壮医桉楝双莲方低剂量组比较，表达量无统计学差异(P>0.05)，阳性对照组与壮医桉楝双莲方中、高剂量组比较，表达量无统计学差异(P<0.05)。表明壮医桉楝双莲方不能明显降低ACD模型小鼠血清中IgE、TFN-α、IL-13、IL-31浓度。见图7-图10。

图7 壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠IgE浓 度水平变化的影响

图8 壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠TNF-α浓 度水平变化的影响

图9 壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠 IL-13浓 度水平变化的影响

图10 壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠 IL-31浓 度水平变化的影响

3 讨论

慢性瘙痒是常见的皮肤病，影响着人们的工作和生活，壮医桉楝双莲方在民间的临床使用范围较广，但是其对慢性瘙痒的治疗机理和疗效并不明晰。本实验对经DNFB敏化以及药物治疗的ACD模型小鼠进行了行为学观察，通过对行为学数据、实验小鼠血清检测数据、小鼠皮损评分数据以及小鼠体重变化等数据的分析，探讨壮医桉楝双莲方治疗小鼠ACD慢性瘙痒的治疗机理和疗效研究。

通过对血液中各种炎性细胞因子检测结果的统计学分析﹙两组间t检验﹚，结果发现：本实验中壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠的慢性瘙痒无明显抑制作用。实验结果误差分析表明：①在实验初期，因对实验流程与具体用药不够熟悉，导致空白对照组多只小鼠因实验操作失误而被处死，使空白组小鼠的实验数据缺失，最终实验缺少了标准对照数据的分析；②治疗药物的提取，采用传统的水煎浓缩法提取实验药物，提取到的药液含杂质较多，药液纯度低。当药物用于实验小鼠局部皮肤时，药物就会附着在小鼠局部皮肤，这就变成了一种促进局部炎症发生的因素，且药物的附着也会使小鼠局部皮肤不能保持干燥，从而影响小鼠炎症的愈合，再者附着的药物影响了后续小鼠的给药治疗和局部药物的吸收，进一步影响了壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠慢性瘙痒的治疗；③在后续对小鼠给药治疗时，由于浓缩药物黏度过大，有部分药物不可避免地黏附在仪器枪上，导致给药量偏低，从而影响壮医桉楝双莲方的治疗效果；④在实验后期，对小鼠眼部取血样时，由于操作不当和部分小鼠体重过低、所采集的血液太少，达不到血清检测的最低标准，减少了实验部分血清检测数据，导致组与组之间组数差别过大，对后面实验数据的分析产生了较大影响。

虽然实验结果表明壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠瘙痒无明显抑制作用，但通过改变壮医桉楝双莲方药液的提取方式，提高提取纯度，减少人为因素的影响，可以进一步验证壮医桉楝双莲方对ACD模型小鼠慢性瘙痒的抑制作用。本研究在一定程度上可对将来深入开展壮医桉楝双莲方抗慢性瘙痒的相关研究提供参考。