甘油和二甲基亚砜溶液低温冷藏蚕卵的效果

刘景瑞 薛彬静 王 飞 王叶元 严会超

（1.华南农业大学动物科学学院蚕丝科学系 广东广州 510642；2.华南农业大学艺术学院 广东广州 510642）

1 前言

1.1 蚕种保存现状

我国作为拥有悠久历史的蚕桑大国，家蚕种质资源丰富，为家蚕遗传育种和遗传学研究提供了良好素材。为避免种质资源消失，建立种质资源库显得尤为重要，而研究家蚕种质资源保存对蚕业可持续发展具有重要意义。

蚕种冷藏是蚕种保护工作的重要措施，生产上蚕卵冷藏的方法主要有滞育卵冷藏法、不完全滞育卵冷藏法、冷藏浸酸种浸酸后的冷藏抑制处理及即时浸酸种浸酸后冷藏等。滞育卵冷藏的方法有单式冷藏和复式冷藏。广东多采用单式冷藏，少数地区采用复式冷藏。单式冷藏适合在用种期不超过140 d 的情况下采用，复式冷藏一般在用种期不超一年的情况下采用。如遇到蚕种供应有余，为减少损失，则采用复式冷藏。不完全滞育卵的冷藏方法如下：蚕卵产后在25 ℃、相对湿度75%～80%的条件下，经过45～62 h（2～3 d），卵色处于赤豆色到深赤豆色之间，此阶段的蚕种可冷藏50～70 d。蚕卵产后在25 ℃、相对湿度75%～80%的条件下，经过72～120 h（3～5 d），卵色处于深赤豆色到固有色之间，此阶段的蚕种可冷藏80～90 d。冷藏浸酸种浸酸后的冷藏抑制处理方法如下：浸酸后的蚕种在25 ℃条件下经过20～24 h，胚子发育到丙1至丙2阶段时，经中间温度13～15℃保护2 h 后移入内库以5 ℃冷藏，冷藏限期为30d左右[1]。

1.2 胚胎动物的保护研究

为保持物种的多样性，物种的生殖细胞保存这一项工作十分重要。低温保存生殖细胞可以抑制细胞的发育，使用保护剂可增强细胞的抗冻性、保持细胞的活性，在需要用细胞时解冻便可以恢复其活性，让其继续发育生长。文献资料显示，目前低温保护生殖细胞的保护剂主要有甘油、二甲基亚砜、海藻糖、乙二醇。这些保护剂主要用于畜牧、水产、生命科学等方面研究。

畜牧方向，郝爱玲等[2]取公牛鲜精液，在4 ℃环境下加入甘油溶液保存6d，从而筛选出有利于牛鲜精4℃保存的最佳甘油浓度为4%；王世银等[3]使用2%、4%、6%、8%四种浓度的甘油、乙二醇和DMSO 作为保护剂，将其添加至鸡精液，结果显示浓度为6%的甘油对鸡精液冷冻保存的保护效果最好，且保护剂组合甘油+DMSO 组冷冻保存的效果略好于其他组。

水产方向，丁淑燕等[4]取兴国红鲤精子加入8% DMSO保护剂，保存于-196 ℃液氮中，在37 ℃水浴锅里水浴100 s解冻，冻存前后的精子密度和活动率均无明显差异；程顺等[5]在超低温环境下冷冻保存大黄鱼精子，以甘油为保护剂，结果显示以5%～20%甘油保护剂保存大黄鱼精子的效果较佳，其中甘油浓度为10%时效果最佳。

生命科学方向，邵同先等[6]取8份志愿者的精液冻存（-196℃）10d，加入复方甘油保护剂，精液解冻激活后镜检，精子活力接近鲜精的水平；齐映亮等[7]选取健康羊膜分为4 组，A 组为空白对照组，B 组为DMEM/甘油/ DMSO/海藻糖组，C 组为DMEM/甘油/DMSO 组，D 组为DMEM/甘油组，冷冻保存后与新鲜羊膜比较，实验结论为DMEM、甘油、DMSO、海藻糖可作为新型保护剂用于精液深低温高活性保存。

从以上实验可以看出，甘油和DMSO 都具有抗冻能力，且增强了动物鲜精和健康羊膜的抗冻性；甘油和DMSO 能在-196 ℃的超低温条件下保护生殖细胞；甘油和DMSO 混合使用也具有抗冻性；冷藏后的鲜精需水浴解冻。实验证明，甘油和DMSO 对血细胞、动物鲜精低温保存有一定的作用。之所以选取甘油或DMSO 作为保护液，是因为甘油是最早、最传统的防冻液，主要运用于植物、动物胚胎、昆虫的低温防冻，或制造业的除冻剂。10%的甘油水溶液冰点为-1.6 ℃，30%的甘油水溶液冰点为-9.5 ℃。DMSO 是一种含硫有机化合物，能够降低细胞冰点，抑制细胞程序性死亡[8]。纯DMSO 的冰点是18.45 ℃，含水40%的DMSO 在- 60 ℃不冻，且DMSO 遇水、雪混合时会放热。因此DMSO 可作涂料等的保护剂，汽油、航煤的防冰剂，以及骨髓、血液、细胞低温保存的保护剂等[9]。

1.3 研究目的及意义

蚕农根据历年的养蚕数量、市场的需求制订下一年的用种计划，为适应用种计划，20世纪80年代开始了蚕种冷藏浸酸技术研究。蚕种冷藏的主要作用是解除蚕卵滞育和抑制蚕卵的发育，以便结合养蚕计划适时出库催青，确保蚕种的孵化率及蚕发育的质量，待保护一定的时间后，通过浸酸的方法来解除滞育。然而生产过程中蚕种发放的规律性极差，常会遇到蚕种冷藏超过期限或者提前出库的问题，这样会导致其成为超期蚕种或者在浸酸时造成蚕卵的浪费，不利于蚕种的供应。因此，生产上需要更灵活的技术方法去适应长期大量养蚕的蚕种需求，冷藏浸酸技术需要更多样性才能适应生产的需求。

经文献查阅，目前仅有关于甘油或DMSO 对动物生殖细胞的保存研究，未见对蚕卵的保存等相关研究文献。Jun Kusu 等[10]将家蚕五龄幼虫卵巢器官芽取出，用不同浓度的甘油处理，在液氮中保存。将解冻后的卵巢移植到五龄雌幼虫体内，根据寄主发育情况，五龄雌幼虫的卵巢中有20%以上发育成带卵壳的成熟卵。通过孤雌生殖激活，成熟卵开始胚胎发育，孵化出幼虫。孵化出的幼虫和正常的幼虫一样完成了胚胎后发育。以上实验说明，甘油对家蚕低温保存有一定的作用。为进一步探索甘油、DMSO 对蚕卵保存的效果，初步筛选出甘油和DMSO 保存蚕卵的条件，期望找出延长保存蚕卵的材料及方法，为蚕种冷藏保护研究提供数据依据。

2 材料与方法

2.1 材料

1.蚕卵品种

大造蚕卵，由华南农业大学蚕丝科学系提供。

2.试剂

甘油（由广州化学试剂生产）、DMSO（由天津市大茂化学试剂厂生产）、纯净水。

3.设备

LRH-250 -HS 恒温恒湿培养箱、松下NR-C320 WP- S三门变频风冷无霜节能多门大冰箱。

2.2 方法

1.试验处理

家蚕在常规条件下饲养和保护，取其母蛾产的蚕卵，分三种处理。

（1）即时浸酸卵。将母蛾产下的卵置于25 ℃、相对湿度75%～85%的环境保护约20 h 后，取蚕卵样品进行即时浸酸，盐酸比重为1.075，液温为46 ℃，浸酸4.5 min；用流动水冲洗脱酸约30 min，晾干；将蚕卵随机分为8 份，每份设3 个重复；在管内分别加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15% DMSO，或不添加任何东西（作为空白对照组）；将放有蚕卵的管分别在4 ℃、0 ℃的条件下保存；定期（每隔10 d）将蚕种样品取出。

（2）赤豆色卵。将蚕卵置于25 ℃、相对湿度75%～85%的环境保护，蚕卵发育至赤豆色时，取蚕卵样品，将蚕卵随机分为8 份，每份设3 个重复；在管内分别加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15% DMSO，或不添加任何东西（作为空白对照组）；将放有蚕卵的管分别在4 ℃、0 ℃的条件下保存；从第40 d 开始，定期（每隔10 d）将蚕种样品取出。

（3）深赤豆色卵。将蚕卵置于25 ℃、相对湿度75%～85%的环境保护，当其发育至深赤豆色时，取蚕卵样品，随机分为8 份，每份设3 个重复；在管内分别加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15%DMSO，或不添加任何东西（作为空白对照组）；将放有蚕卵的管分别在4 ℃、0 ℃的条件下保存；从第80 d 开始，定期（每隔10 d）定期将蚕种取出。

2.冷藏后的处理

取出蚕卵，用恒温水浴锅在37 ℃下解冻10 s，分别洗净甘油和DMSO，晾干。即时浸酸卵晾干，放入25～26 ℃、相对湿度75%～80%的恒温恒湿人工气候箱中催青至孵化；而赤豆色卵和深赤豆色卵采用冷藏浸酸法进行浸酸，盐酸比重为1.092，液温为47.8 ℃，浸酸5 min。取出蚕卵在流动水中冲洗约30 min，晾干，放在25～26 ℃、相对湿度75%～80%的恒温恒湿人工气候箱中催青至孵化。

3.计算孵化率

计算实用孵化率。

2.3 数据分析

本研究采用IBM SPSS Statistics 22.0 软件进行多因素方差分析，使用邓肯氏新复极差检验法（DMRT 法）进行多重比较。

3 结果

3.1 即时浸酸卵用不同保护剂保存的效果

即时浸酸卵用不同浓度的保护剂保存，实验结果如表1。总体上看，4 ℃下冷藏的蚕卵效果较0 ℃的好；加了保护剂的蚕卵孵化率高于空白对照组，随着冷藏时间的增加，孵化率逐渐降低；4 ℃和0 ℃下冷藏10 d 的效果最佳，孵化率均在93%以上，特别是温度在4℃时，孵化率为100%。4 ℃冷藏30 d，5%甘油、10%甘油、5%DMSO 及10%DMSO的孵化率都在80%以上，比空白对照组分别提高了52.63%、52.63%、40.35%、45.61%。4℃下，5% DMSO保护剂的冷藏效果是最好的，主要体现在冷藏20 d、30 d、40 d、50 d 的孵化率比空白对照组分别提高了12.05%、40.35%、334.78%、142.86%；0℃下，5% DMSO、10%DMSO 保护剂的冷藏效果最好，对于5% DMSO 来说，冷藏20 d、30d、40 d 的孵化率比空白对照组分别约提高了4.30%、33.33%、100%，对于10% DMSO来说，冷藏30 d、40 d 的孵化率比空白对照组分别约提高了 16.67%、76.67%。特别是4 ℃下，加水冷藏10～80 d 的蚕卵一直都有孵化，只是孵化率低，孵化率最高出现在冷藏10 d，为100%；孵化率最低出现在冷藏70～80 d。

3.2 赤豆色卵用不同保护剂保存的效果

赤豆色卵用不同浓度的保护剂保存，实验结果如表2。总体上看，加保护剂的蚕卵孵化率均达不到实用孵化率要求。4 ℃冷藏的蚕卵孵化率较0 ℃的高，但随着冷藏时间的增加，孵化率逐渐降低，冷藏50 d 的效果最佳；对于4 ℃来说，空白对照组的孵化率高于加了保护剂和水的，所以保护剂在4℃的冷藏中效果不佳，其中水和DMSO 的效果较其他保护剂好，冷藏40 d 以5% DMSO 较好、冷藏50 d 以10%DMSO 较好，但变化规律不显著；对于0 ℃来说，冷藏50 d 的效果最佳，且用5%甘油保存孵化率达到83%，其中40～60 d，加了5%甘油保护剂的蚕卵保存效果最佳，而70～80 d，空白对照组和加水保存的孵化率逐渐增加明显，空白对照组的孵化率从10%增加到73%，加水保存的蚕卵孵化率从7%增加到50%。

3.3 深赤豆色卵用不同保护剂保存的效果

深赤豆色卵用不同浓度的保护剂保存，实验结果如表3。总体上看，0 ℃下冷藏的蚕卵孵化率较4 ℃的高，孵化率最高出现在冷藏80 d。4 ℃下，加DMSO 保存的蚕卵孵化率均为100%，加水、15%甘油保存的蚕卵孵化率为93%；0℃下，加水、5%甘油、10%甘油、10% DMSO、15% DMSO 保存的蚕卵孵化率均为100%，加5% DMSO 保存的蚕卵孵化率为93%。对4℃来说，10% DMSO 的保护效果最好，冷藏120 d 前孵化率逐渐降低，120 d 后加了保护剂的蚕卵孵化率有上升趋势。对于0℃来说，加了水保存的蚕卵效果最佳，特别在第200 d，孵化率高达97%，其次是10% DMSO；孵化率较低的情况大部分出现在120～160 d内，其中孵化率最低的是用5% DMSO 保存的蚕卵，孵化率仅为7%。

表1 即时浸酸卵用不同保护剂保存的孵化率调查

表2 赤豆色卵用不同保护剂保存的孵化率调查

续表2赤豆色卵用不同保护剂保存的孵化率调查

表3 深赤豆色卵冷藏用不同保护剂保存的孵化率调查

4 讨论

4.1 不同试剂保护

对于不同方法处理的蚕卵、不同时期的蚕卵，分析数据可得DMSO 保护剂的冷藏效果更佳、水次之。即时浸酸卵，4 ℃下，5% DMSO 保护剂冷藏效果最佳，0 ℃下，10%DMSO 保护剂冷藏效果最佳；赤豆色卵，4 ℃下，水和5%DMSO 保护剂冷藏效果较佳，0 ℃下，5%甘油保护剂冷藏效果最佳；深赤豆色卵，4 ℃下，5% DMSO 保护剂冷藏效果最佳，0 ℃下，水和10% DMSO 保护剂冷藏效果最佳。

4.2 不同温度保护

对于即时浸酸卵和赤豆色卵来说，4 ℃保护效果最佳；对于深赤豆色卵来说，0 ℃保护效果最佳。温度对不同发育时期胚胎的保存效果存在差别，这可能与胚子耐低温能力有关，有待进一步研究。

4.3 不同发育期胚胎

滞育蚕卵比解除滞育的蚕卵孵化率不论是在4 ℃下还是0 ℃下都更高，发育都更整齐，由此可见，滞育蚕卵抗冻效果更好；随着冷藏时间的增长，深赤豆色卵的孵化率呈上升趋势，可见深赤豆色卵的耐冷藏能力较赤豆色卵的好，猜测固有色的耐冷藏能力可能会更佳；从表3可以看出，0 ℃下冷藏214 d，10% DMSO 的保护效果比空白对照组好，可以推断，固有色的蚕卵用保护剂效果可能会更好。对于即时浸酸卵，冷藏天数越多，加了保护剂保存的蚕卵孵化率越高于或持平于空白对照组，由此可以初步分析出，DMSO 或甘油对解除滞育的蚕卵有一定的保护作用。而对赤豆色卵用DMSO或甘油保存并没有这样的效果。深赤豆色卵随着冷藏天数的增加孵化率提高，可能原因是随着时间的增加，蚕卵自身解除滞育。联系表1可以看出，保护剂对解除滞育的蚕卵是有一定的保护作用的。

4.4 试验中可能存在问题

对于赤豆色的蚕卵，4 ℃条件下、冷藏60 d 的这一批蚕卵的孵化率为0，初步判定为操作不当导致的，因为在冷藏70 d 时，用水、甘油和DMSO 保存的蚕卵依然有孵化。本实验只是初步研究，在无前人试验参考基础上摸索，还有很多工作有待通过进一步试验研究与完善。

4.5 展望

在0 ℃条件下、冷藏200 d 的蚕卵，空白对照组和加水保存的孵化率都高于95%，加水的保存可以做进一步研究；到冷藏214 d 时，加了水的蚕卵孵化率达90%，明显高于其他试剂及空白对照组。加水保存蚕卵的冷藏效果可做进一步研究。

5 结论

对于用甘油和DMSO处理的蚕卵，赤豆色蚕卵使用冷藏的效果不明显，而深赤豆色蚕卵随着冷藏天数的增加，使用保护剂有一定效果，但孵化率没有达到生产上实用孵化率90%以上要求，但对种质资源的保护保存仍具有一定科学意义。而对于已经解除滞育的蚕卵来说，保护剂具有一定的作用，特别是DMSO，增强了蚕卵的抗冻性｡ 加水保存的蚕卵是否增强了抗冻能力尚待进一步研究｡