戴尔有孢圆酵母对品丽珠和马瑟兰葡萄酒香气物质的影响

宿萌，李蕊蕊，王欢，肖冬光，郭学武，陈叶福

(天津科技大学 生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津，300457)

葡萄酒发酵过程中，非酿酒酵母往往被忽略或者被视为微生物变质的源头[1]。近年来，为了解决纯酿酒酵母菌株发酵带来的风味均质化问题，葡萄酒微生物学家重新审视了这些酵母在葡萄酒发酵中的作用[2-3]。有研究发现，不同非酿酒酵母可以产生不同的酯类、高级醇、脂肪酸以及醛酮等代谢产物，影响风味物质形成，进一步影响葡萄酒的感官品质[4-5]。与酿酒酵母相比，非酿酒酵母表现出较好的胞外酶活，其分泌的β-D-葡萄糖苷酶可以水解糖苷结合的非挥发性香气化合物，从而促进单萜、C13-降异戊二烯和苯衍生物等挥发性物质的释放[3,6]，有利于更好地改善葡萄酒的香气，提高葡萄酒的复杂性。

由于这些酵母的发酵性能较差，研究人员往往将其和酿酒酵母结合在一起进行混合发酵[7]。戴尔有孢圆酵母作为最受关注的非酿酒酵母之一，其贡献主要是提高脂肪酸乙酯的含量[8-9]，且与酿酒酵母共发酵时，能够有效地降低乙酸及挥发酸的含量，提高葡萄酒的感官特性[10]。SUN等[11]发现戴尔有孢圆酵母参与的混合发酵能够有效增强果香，减少生青味；原苗苗等[9]发现其参与的接种发酵均可增强发酵香气，尤其是辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯等乙基酯的含量有明显提升；ZHANG等[12]发现戴尔有孢圆酵母与不同的酿酒酵母混合发酵对葡萄酒的理化品质和香气质量的影响各不相同，且顺序接种可以更好地增加香气的多样性。此外，相较于其他非酿酒酵母，戴尔有孢圆酵母不仅对各种浓度糖、酒精和SO2的耐受性较强[13]，还具有较快的生长速率和糖消耗速率[14]，因此适用于葡萄汁的高糖度发酵。

目前，关于戴尔有孢圆酵母对于香气物质的影响已经引起国内越来越多研究人员和酿酒师的关注[15]，但研究主要集中于赤霞珠葡萄，对于其他不同葡萄品种的酒样香气并没有系统性研究。本实验以山东省蓬莱市的品丽珠和马瑟兰葡萄为原料，分别选择酿酒酵母、戴尔有孢圆酵母单独发酵以及两者顺序接种发酵3种不同的接种方式，采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)检测发酵酒样中香气物质，验证戴尔有孢圆酵母对葡萄酒香气的共性影响，同时探索品丽珠和马瑟兰葡萄酒香气物质的差异性，以期为戴尔有孢圆酵母更好地应用于葡萄酒的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

葡萄品种：品丽珠(Cabernet Franc，CF)、马瑟兰(Marselan，MS)，山东省蓬莱市中粮长城(烟台)有限公司新港基地。

菌株：酿酒酵母71B、戴尔有孢圆酵母ZYMAFLORE AlphaTD n.Sacch(Laffort，Bordeaux，France)，上海杰兔工贸有限公司。

试剂：NaOH(分析纯)、无水乙醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；偏重亚硫酸钾(食品级)，法国LAFFORT公司；浓HCl(分析纯)，莱阳市康德化工有限公司；CuSO4(分析纯)、酚酞(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；次甲基蓝(分析纯)，天津市化学试剂三厂；4-甲基-2-戊醇(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

LRH-150型生化培养箱，上海一恒科技有限公司；MS204S型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；pHSJ-4A型台式pH计，上海科学仪器有限公司；1260高效液相色谱仪，Agilent Technologies；57328-U D B/CAR/PDMS复合萃取头，美国Supelco公司；PAL RSI85 SPME进样器，美国CTC公司；7890B气相色谱仪、5977A质谱仪，Agilent Technologies；DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)，美国J&W公司。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄酒酿造

酿酒葡萄→除梗破碎→室温浸渍24 h，皮渣分离，低温澄清→葡萄汁分装→105 ℃灭菌15 min→冷却→28 ℃接种酵母进行发酵(非酿酒酵母接种48 h后接种酿酒酵母)

酵母添加量如表1所示，每个处理3个平行。

表1 接种处理方式 单位：g/L

1.3.2 葡萄酒理化指标测定

总酸、酒精度和pH等基本指标的测定均参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.3 挥发性化合物测定

挥发性化合物的萃取与GC-MS分析条件参照原苗苗等[9]方法，具体操作如下:

挥发性物质的富集：取8 mL葡萄酒、2.00 g NaCl和20 μL 2.00 g/L的4-甲基-2-戊醇(内标物)以及转子于15 mL顶空瓶中，密封并摇匀，置于45 ℃的可加热磁力搅拌器上，预热10 min后，萃取50 min。

色谱条件：气相色谱仪为配备有5977A MSD的Agilent 7890B；色谱柱DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持2 min，以6 ℃/min的速度升至230 ℃，保持15 min；载气为He，平均线速度为25 cm/s；不分流进样模式。

质谱条件：电子能量70 e ；质谱扫描范围30～400 u，在3.9次/s扫描速度下获得。

1.3.4 挥发性化合物的定性定量分析

定性分析：运用计算机谱库(NIST14)对得到的MS图进行初步检索和分析，再结合有关质谱资料、保留时间以及相对峰度等方面的研究进行人工谱图解析，确定挥发性物质的各个化学成分。

定量分析：采用内标法定量，计算样品中各香气组分的含量。

1.3.5 数据处理

采用SPSS 17.0软件进行方差分析，多组间比较采用One-Way ANO A法，P<0.05认为存在显著性差异；采用SIMCA 13.0软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)，以此获得样品分类信息；采用Heml软件对样品作热图统计分析；采用Origin 8软件进行香气叠加分析。

2 结果与分析

2.1 品丽珠和马瑟兰葡萄酒的基本理化指标

表2显示了酒精发酵结束后品丽珠和马瑟兰葡萄酒的基本理化指标。酒样中残糖含量为1.71～2.30 g/L，表明所有的接种组均已完成酒精发酵，且混合发酵的实验相较于对照组发酵更为完全。与CF-71B和MS-71B单独发酵相比，戴尔有孢圆酵母单独发酵和混合发酵酒样中滴定酸含量显著降低，可能是因为在混合发酵过程中，酿酒酵母与非酿酒酵母之间存在某些相互作用，使酵母分解有机酸的能力强于产酸能力，但具体作用机制未知[16-17]。此外，BELDA等[18]研究发现，戴尔有孢圆酵母参与发酵能够产生较低浓度的酒精；BASSO等[19]也曾提出，戴尔有孢圆酵母是探索低度啤酒新领域过程中最有希望的酵母。而本实验相应的4组实验中酒精度并未发现显著降低，可能是由于气候变化影响了葡萄中酚成熟度和单宁含量[20]，也可能是与实验所用的戴尔有孢圆酵母菌株有关。

表2 品丽珠葡萄糖和马瑟兰葡萄酒的基本理化指标Table 2 Basic physicochemical indexes of Cabernet Franc and Marselan wines

2.2 品丽珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒的香气成分

香气是葡萄酒感官品质的重要方面，大多数香气化合物是在酒精发酵过程中合成的，是酵母的次级代谢产物，受葡萄品种、酵母菌株及葡萄酒生产工艺等多种因素的影响[21]。本实验品丽珠葡萄酒中含有58种香气化合物，而马瑟兰葡萄酒中含有60种。气味活性值(odor acti ity alue,OA )>1的化合物对葡萄酒的香气有很高贡献[22]，因此，将表3中OA >1的香气化合物划线并进一步整理(表4)。品丽珠葡萄酒中OA >1的香气化合物有16种，包括4种醇类、7种酯类、1种脂肪酸、1种羰基化合物和3种萜烯类化合物；而马瑟兰葡萄酒中OA >1的香气化合物有17种，与品丽珠葡萄酒相比，虽然少了丁酸乙酯，但产生的α-紫罗兰酮和β-大马酮能够在一定程度上提高葡萄酒的花香和果香，从而提高葡萄酒香气的复杂性。此外，为了更加直观地看出各种物质含量之间的差异，对OA >1的香气化合物作热图统计分析(图1)。

2.2.1 醇类

高级醇是香气化合物中最大的一类化合物。葡萄酒中高级醇的质量浓度在300～400 mg/L时是可以被接受的，且当其处于最佳质量浓度(<300 mg/L)时，具有令人愉悦的特性[23]。本实验在品丽珠和马瑟兰葡萄酒酒样中检测到醇类各16种，其中异戊醇、庚醇、2-壬醇和苯乙醇的质量浓度均高于其阈值。结合表3和图1-b来看，苯乙醇和总高级醇的质量浓度在CF-TD中达到最高，分别为62.86和136.1 mg/L，其中高级醇的总量达到了香气总量的59.53%；与品丽珠葡萄酒相比，马瑟兰葡萄酒中醇类的含量存在一定差异，这可能是由于不同葡萄品种中存在的氨基酸种类不同[24]。与MS-71B和MS-TD相比，MS-MIX中苯乙醇的浓度显著增加，可能与戴尔有孢圆酵母中β-葡萄糖苷酶的活性有关[7]。

表3 品丽珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒中香气化合物的质量浓度 单位：mg/mL

续表3

表4 品丽珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒中香气成分的OA 值(OA >1)Table 4 OA alues of Cabernet Franc and Marselan wines

a-各类化合物总含量的热图比较分析结果;b-醇类、酯类化合物含量的热图比较分析结果;c-脂肪酸、羰基类和萜烯类化合物含量的热图比较分析结果图1 品丽珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒挥发性化合物含量的热图比较分析结果Fig.1 The comparison and analysis of heat map for the olatile compounds in Cabernet Franc and Marcelan wines注：图a根据所有检测出的各类挥发性化合物的总含量作图；图b和图c根据OA >1的挥发性化合物的含量作图

2.2.2 酯类

酯类是葡萄酒中重要的香气化合物，对葡萄酒果香的产生具有积极的贡献[12]。本实验在马瑟兰葡萄酒酒样中鉴定出24种酯，其中6种达到其阈值，包括乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯；品丽珠葡萄酒酒样中鉴定出23种酯，其中7种达到其阈值。由表3和图1-b可知，马瑟兰葡萄酒能够产生更丰富的酯类化合物。在戴尔有孢圆酵母单独发酵的2组实验中，产生的乙酸异戊酯质量浓度最高，分别达到了3.28和3.85 mg/L，另外在这2组实验中，乙酸乙酯的质量浓度要高于其他组，与前人研究结果一致[7]，但乙酸乙酯的质量浓度低于其阈值，因此不会对葡萄酒的香气产生不利影响。关于乙基酯， IANA等[25]曾提出，辛酸乙酯的存在似乎是戴尔有孢圆酵母的一大特征。结合图1-b来看，在CF-TD、MS-TD以及MS-MIX中也说明了这点，相比起酿酒酵母71B单独发酵，这3组实验中辛酸乙酯的质量浓度明显较高。

2.2.3 酸类

酸类化合物是葡萄酒中另一种重要的香气化合物，可以赋予葡萄酒以果香、奶酪、脂肪和腐烂的风味[9,26]。在低质量浓度下，酸类化合物可以提高葡萄酒的复杂性；在高质量浓度下，会对葡萄酒的香气产生负面影响[27-28]。本实验在品丽珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒酒样中均检测出6种酸类化合物，其中仅癸酸的质量浓度超过了其阈值。由表3和图1-c可知，戴尔有孢圆酵母单独发酵及混合发酵的酒样中，酸类化合物的总质量浓度显著高于对照组，与原苗苗等[9]研究结果一致，可能是因为戴尔有孢圆酵母更有利于有机酸的积累[29]。TONDINI等[30]在基因表达和酿酒学特性的研究中提出，相比酿酒酵母，戴尔有孢圆酵母中的乙醇脱氢酶基因ADHs的转录水平始终高于乙醛脱氢酶基因ALDs，使得更多乙醛生成乙醇，从而产生较少的乙酸；另外，相较于乙酰辅酶A水解酶基因(ACH1)，戴尔有孢圆酵母倾向于表达更高水平的乙酰辅酶A合成酶基因(ACSs)，有利于消耗乙酸生成乙酰辅酶A。因此，在戴尔有孢圆酵母单独发酵以及其参与的混合发酵实验中乙酸含量应该有明显降低，而在本实验中得到的结论与此相反，这可能和实验选择的菌株有关。

2.2.4 萜烯类

萜烯为葡萄酒提供花香以及果香，且阈值较低，因此较低含量的萜烯也会在一定程度上影响葡萄酒的香气。本实验中，分别在品丽珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒酒样中检测出6种和7种萜烯类化合物，且里那醇、香茅醇、香叶醇及马瑟兰葡萄酒酒样中的α-紫罗兰酮与β-大马酮的OA 值都很高，说明其对2种葡萄酒的风味物质具有较大贡献。此外，萜烯类化合物在不同的葡萄品种酒样中种类差距很大(图1-c),如在品丽珠葡萄酒中未检测到α-紫罗兰酮和β-大马酮；在马瑟兰葡萄酒酒样中，也并未检测到雪松醇。另外，马瑟兰葡萄酒中的萜烯类化合物质量浓度普遍高于品丽珠葡萄酒，说明相较于后者，前者的花香和果味更为浓郁。且相比于MS-71B，MS-MIX中里那醇、香茅醇、 β-大马酮以及总萜烯类的浓度均有不同程度的提高，这可能是由于戴尔有孢圆酵母分泌的β-D-葡萄糖苷酶水解了非挥发性糖苷物质，从而促进了萜烯类物质的释放，与WHITENER等[31]的结论一致。

2.3 品丽珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒的香气主成分分析

由于葡萄酒香气成分复杂、差异较大[27]，为直观展示6个酒样的香气特点，对表4中的数据进行主成分分析。由图2-a可知，PC1正半轴上主要分布着能够赋予葡萄酒花香味的萜烯类化合物及具有醇香味的高级醇，负半轴上的香气化合物主要为具有果香的酯类化合物；PC2正半轴上分布着绝大多数的香气化合物，而负半轴上分布的信息较少。由图2-b可知，PC1正半轴上主要分布着酯类化合物、萜烯类化合物以及大部分的高级醇，而负半轴上分布的香气信息较少；PC2正半轴上主要是酯类和萜烯类化合物，其负半轴得分较高的有香叶醇、己酸乙酯、α-紫罗兰酮、2-壬酮和庚酸乙酯等。

由图2可知，2个葡萄品种的香气化合物在PC1、PC2所形成的二维平面上的位置存在明显差异，说明葡萄品种是影响葡萄酒香气成分的主要因素。MS-TD酒样在PC1正半轴上得分较高，因此其花香、水果香气丰富浓郁，且伴有醇香。同样的，CF-TD酒样在PC2负半轴上得分较高，即该酒样具有花香的特点。由此可知，戴尔有孢圆酵母对于不同葡萄品种酒样的香气影响很大。另外，相比于CF-MIX与CF-71B之间的距离，MS-MIX与MS-71B之间相距较远，说明马瑟兰葡萄酒中混合发酵对于香气的改善更为明显，从而进一步证明了戴尔有孢圆酵母对葡萄酒香气品质的影响与葡萄品种有关。因此在葡萄酒酿造过程中，需要根据葡萄品种选择合适的酵母。

a-品丽珠葡萄酒主成分分析图; b-马瑟兰葡萄酒主成分分析图图2 不同葡萄品种酒样的主成分分析图Fig.2 Principal component analysis of wine samples from different grape arieties

2.4 OA 叠加香气分析

为了揭示戴尔有孢圆酵母对葡萄酒香气特征的影响及不同香气化合物对葡萄酒嗅觉的影响，将具有相似气味描述的挥发物OA (OA >1)叠加，从而建立芳香系列[12](图3)。根据前人的研究[19,32-34]，这些化合物的香气与“香蕉”、“青苹果”、“柠檬”、“玫瑰”、“果味”、“蜂蜜”、“脂肪”、“油腻”和“溶剂”相关，最终获得6种芳香系列的挥发性化合物，包括果香、花香、甜果、草本、化学和脂肪。其中，花香和果香系列最为突出，其次是脂肪、甜果、草本和化学系列。与品丽珠葡萄酒相比，马瑟兰葡萄酒中果香和花香系列香气明显增加，尤其是MS-MIX中，花香、果香系列香气达到最高，一方面由于产生较多的苯乙醇、癸酸乙酯和辛酸乙酯；另一方面，虽然己酸乙酯、庚酸乙酯、α-紫罗兰酮和β-大马酮的质量浓度较低，但因其对应的阈值偏低，所以果香和花香气味明显。

图3 OA 叠加香气分析图Fig.3 Aroma analysis chart of superimposed OA注：花香系列化合物：苯乙醇、香茅醇、里那醇、β-大马酮；果味系列化合物：2-壬醇、香叶醇、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、α-紫罗兰酮、β-大马酮；甜味系列化合物：苯乙醇、α-紫罗兰酮；草本系列化合物：2-壬醇、香叶醇；化学系列化合物：异戊醇；脂肪系列化合物：庚醇、癸酸、癸酸乙酯、月桂酸乙酯

3 结论

研究发现，戴尔有孢圆酵母单独及混合发酵均可降低葡萄酒中滴定酸的含量。戴尔有孢圆酵母参与的发酵有利于葡萄酒中苯乙醇、脂肪酸乙酯(辛酸乙酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯等)的合成，从而大大增加了葡萄酒的花香和果香。戴尔有孢圆酵母对葡萄酒香气质量的影响因葡萄品种不同而不同，马瑟兰葡萄酒比品丽珠葡萄酒的香气更加浓郁，其中在MS-TD中，芳香物质葡萄酒质量浓度达到最高，为242.67 mg/L；另外，在马瑟兰葡萄酒中检测出了α-紫罗兰酮和β-大马酮，其他萜烯类化合物的含量也有显著提高，使葡萄酒中花香、果香气味更加显著，MS-MIX中葡萄酒的花香和果香系列香气达到最高。因此，本研究通过验证戴尔有孢圆酵母对葡萄酒共性的影响以及探索2种葡萄酒香气物质的差异性，为戴尔有孢圆酵母更好地应用于葡萄酒的生产提供了理论依据。