基于网络药理学的熟地黄环烯醚萜类成分治疗类风湿性关节炎作用机制的初步探究

张冬丽，于欢，李敏，唐生安

（天津医科大学天然药物学系，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因尚未完全阐明的系统性炎症性自身免疫病，其主要特点是关节滑膜炎的产生、血管翳的形成和软骨破坏。滑膜炎持久反复发作，导致关节内软骨及骨的破坏，严重影响患者的生活质量和身体健康[1]。现代医学药物治疗RA 主要有非甾类抗炎药，如美洛昔康、塞来昔布；生物制剂，如依那西普、英夫利昔单抗和糖皮质激素等，这些药物虽能缓解RA 病情，但具有一定的毒副作用。中药具有多成分、多靶点、多途径的治疗特点，一定程度上可以弥补西药带来的不良反应，为进一步寻找抗RA 药物提供新方向。

熟地黄（Rehmanniae Radix Praeparata）为玄参科、地黄属植物。生地黄甘苦而寒，具有清热凉血、养阴生津的作用；而熟地黄甘温味厚，具有滋阴补血、益精填髓的功效[2]。根据RA 的证候特点不同，熟地黄多用于治疗肾虚寒凝型、气血亏虚型、寒湿痹阻型RA[3]。研究表明，六味地黄汤可以通过调节机体的免疫功能状态、恢复免疫平衡实现治疗自身免疫性疾病[4]。但由于自身免疫性疾病发病机制较复杂，熟地黄中有效成分和作用机制并不明确。因此，本文利用网络药理学对熟地黄环烯醚萜类成分进行筛选，预测其作用的与RA 有关的靶点及相关通路，构建“成分-靶点-通路”网络图，直观地展示熟地黄环烯醚萜类成分主要作用的靶点和通路，预测其作用机制。

1 材料与方法

1.1 候选成分的虚拟筛选 首先通过查找文献得知熟地黄环烯醚萜类成分有促进骨细胞的增殖、分化和免疫调节的作用[5]，提示熟地黄环烯醚萜类成分具有抗RA 活性。利用中药系统药理数据库（TCMSP）检索熟地黄成分，可以找到26个环烯醚萜成分，从中筛选出类药性（DL）≥0.18 且具有较多作用靶点的5个成分，分别为：梓醇（1）、益母草苷（2）、桃叶珊瑚苷（3）、（2S，3R，4R，5S，6R）-2-{[（1S，4aS，5R，7aR）-4a，5-dihydroxy-7-methylol-5，7adihydro-1H-cyclopental9（c）pyran-1-yl]oxy}-6-methylol-tetrahydropyran-3，4，5-triol（4）、京尼平苷（5），结构见图1。

图1 熟地黄环烯醚萜类成分结构Fig 1 The structure of ilidoids from Rehmanniae Radix Praeparata

1.2 候选成分靶点预测 通过PubChem 数据库查找候选成分相关的分子信息及生物学测试[6]和TCMSP 数据库进而确定各成分潜在的作用靶点。采用UniProt KB 搜索功能得到这些靶蛋白的UniProt ID，基因名称及其正确名称。

1.3 靶点的筛选 在治疗靶标数据库（TTD）中输入关键词“rheumatoid arthritis”，可以得到有关RA的靶点信息；在DrugBank 数据库中搜索美国食品药品监督管理局（FDA）批准的抗RA 药物的靶点，将两个数据库得到的与RA 相关的靶点信息进行整合。预测的候选成分的靶点与RA 相关靶点进行比对分析，得到靶点中有明显抗RA 作用的靶蛋白，并统计频次。

1.4 相关通路获取及分析 将比对之后的靶蛋白的UniProt ID 导入生物学信息资源数据库David（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），得到靶点的相关通路信息后进行GO 富集分析和KEGG 通路注释分析。参数设置如下：Identifier：UNIPROT_ACCESSION；List Type：Gene List；Species：Homo sapiens（Human）。在分析报告的“Functional Annotation Chart”中通过P 值（P＜0.05 为差异有统计学意义）进行筛选。

1.5 “成分-靶点-通路”网络构建 以选取的5个成分、比对分析过的靶点和通路建立相互关系，导入Cytoscape3.7.0 软件，分析熟地黄环烯醚萜“成分-靶点-通路”的网络图。

2 结果

2.1 熟地黄环烯醚萜类成分的潜在靶点信息 将PubChem 数据库中获得的靶点信息与TTD 数据库和DrugBank 数据库中获得的与RA 相关的靶点信息进行比对，得到13个重复靶点，即可能为熟地黄环烯醚萜类成分治疗RA 的潜在作用靶点，见表1。

对比筛选出的各靶点的网络节点度（Degree），肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）较高，为网络中的枢纽节点，提示它们可能是熟地黄环烯醚萜类成分抗RA的关键作用靶点。在表1 的基础上，对5个成分作用的靶点数进行归纳，见表2。

表2 熟地黄环烯醚萜成分的潜在靶基因和靶点数Tab 2 Potential target genes and target number from the iridoid constituents of Rehmanniae Radix Praeparata

5种化合物的母核都是环烯醚萜结构。由表2可知，桃叶珊瑚苷和京尼平苷的靶点数较多，与其他成分比较，提示桃叶珊瑚苷和京尼平苷具有相对较好抗RA 活性。可见熟地黄环烯醚萜的不同化学成分不仅可以作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，体现了其多成分、多靶点的抗RA 机制。

2.2 熟地黄环烯醚萜成分潜在靶点的生物学过程和通路注释分析 从13个靶点中筛选出9个靶点(JAK2、IκBα、IL-1β、IL-6、TNF、Bcl-2、TP53、TLR9、PTGS2)进行生物学过程分析和通路注释分析，得到15 条通路信息及靶点的生物学过程，主要富集在炎症反应、脂多糖调节的信号通路、凋亡过程、IL-6 产生的正向调控、NF-κB 转录因子活性的正向调控、NF-κB 导入细胞核的正向调控、NO 生物合成的正向调控等生物学过程。其中有5 条通路与RA 直接相关[7-9]，包括NF-κB 信号通路、TLR 信号通路、TNF 信号通路、NOD 样受体信号通路和细胞凋亡，见表3。

表3 RA 相关信号通路所包含的靶基因Tab 3 Target genes involved in RA related signaling pathways

根据表3 可知，5 条通路与免疫调节和细胞凋亡相关，属于细胞因子和细胞调节通路[10]，提示熟地黄环烯醚萜成分主要通过这两类通路产生抗RA 活性。

靶点参与的主要通路注释分析如图2 所示。

图2 KEGG 通路富集分析结果Fig 2 The result of KEGG pathway enrichment analysis

2.3 熟地黄环烯醚萜“成分-靶点-通路”网络构建 图中共29个节点，包括5个成分、9个靶点、15条通路。从图3 中可以看出，除了2.2 中提到的6条与RA 直接相关的通路外，还涉及其他通路，比如甲型流感、肺结核、利什曼病、麻疹、单纯疱疹感染、乙型肝炎、非洲锥虫病等，这些通路与免疫系统、细胞生存与凋亡有关，从不同角度揭示了熟地黄环烯醚萜成分具有抗RA 活性的特点[11]。

图3 熟地黄环烯醚萜“成分-靶点-通路”网络图Fig 3 “Components-targets-pathways”network of the iridoid constituents of Rehmanniae Radix Praeparata

3 讨论

中医药历经千百年的临床实践，积累了丰富的经验。中药及其方剂具有多成分、多途径和多靶点协同作用等特点，在防治复杂疾病方面具有其自身的特色和优势。网络药理学是一种系统的方法，它是以“疾病-基因-靶点-药物”网络模型的形式发展起来的，从多维的角度解释和评价药物的分子机制。它可以在靶点-通路识别以及说明药物靶点相互作用等方面发挥作用，并利用药物-靶点相互作用网络阐明药物的作用机制[12]。因此，在对传统药物进行作用机制的研究中，可以利用网络药理的方法，对其进行初步探索。

既往研究表明，许多细胞因子是RA 产生炎症反应和关节损伤的重要介质，与RA 密切相关的细胞因子有IL-1、TNF-α、IL-6，而TNF-α 在炎症反应中是关键的细胞因子，若抑制其产生，则IL-1、IL-6 的产生也会相对减少[13]。NF-κB 是一种重要的转录因子，可以促进其他炎症因子，如TNF-α、IL-1β 的产生[14]。IκBα 作为NF-κB 抑制剂，可以抑制NF-κB活性，使其在RA 滑膜组织中的含量下降。

Bi 等[15]发现梓醇在星形胶质细胞的炎症反应中可以抑制PTGS2 的产生，使NF-κB 失活可能是其抗炎机制的主要决定因素。Park[16]研究发现，桃叶珊瑚苷能够抑制细胞外信号调节激酶(ERK)活性、Iκ-Bα 降解和随后的NF-κB 活化。Wang 等[17]发现桃叶珊瑚苷在大鼠关节软骨细胞中可以抑制PTGS2 的产生，并且抑制IL-1β 诱导炎症反应及软骨基质降解，其作用是通过抑制NF-κB 信号通路活性实现的。Pan 等[18]发现京尼平苷可以促进经IL-1β 刺激的大鼠软骨细胞中胶原蛋白Ⅱ的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达。

本文以熟地黄环烯醚萜类的5个成分为研究对象，进行靶点预测，采用网络构建以及通路注释分析的网络药理学方法对熟地黄潜在的抗RA 作用机制进行研究，发现桃叶珊瑚苷和京尼平苷作用的与RA 相关的靶点较多，为熟地黄环烯醚萜类化合物发挥抗RA 活性的关键成分；TNF、IL-1β、IL-6、IκBα 是关键靶点；由GO 分析和KEGG 通路注释分析结果可知，熟地黄环烯醚萜成分作用的靶点主要通过炎症反应、凋亡过程、IL-6 产生的正向调控、NF-κB 转录因子活性的正向调控等生物学过程，在NF-κB 信号通路、TLR 信号通路、TNF 信号通路、细胞凋亡中发挥抗RA 活性。本研究阐明熟地黄环烯醚萜类化合物抗RA 的“多成分-多靶点-多通路”作用机制特点，为深入研究熟地黄抗RA 的作用机制奠定了基础。