IL-17A 可以促进卵巢癌的腹腔转移

李岩，牛秀珑，郁春艳，陈燕，沈洋洋，邓为民

（1.天津医科大学基础医学院免疫学系，国家教育部免疫微环境与疾病重点实验室，天津300070；2.中国人民武装警察部队特色医学中心勤务环境皮肤疾病防治研究所，天津300162）

卵巢癌（ovarian cancer，OvCa）是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，转移和耐药使OvCa 的5年生存率为30%左右，病死率居于女性生殖系统恶性肿瘤的首位[1]。研究发现，OvCa 患者体内白细胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）水平增高，且与肿瘤进展密切相关[2]。IL-17A 是IL-17 细胞因子家族中（IL-17A～IL-17F）最早被发现也最具有代表性的一员，是一种多效性炎症因子，主要通过IL-17RA发挥作用[3-4]。同时有研究表明IL-17A 是血管生成因子，IL-17A 在肿瘤组织中的高表达与肿瘤的血管生成有密切联系，而血管生成又与肿瘤转移侵袭密切相关[5]。腹腔转移是OvCa 最常见的转移方式[6]，但IL-17A 在OvCa 腹腔转移中的作用及其相关机制未见报道，需进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠OvCa 细胞系ID8 细胞由堪萨斯大学医疗生殖中心惠赠；C57BL/6 遗传背景的野生型（WT）小鼠购自中国军事医学科学院实验动物中心；C57BL/6 遗传背景的IL-17A-/-小鼠购自日本东京理科大学生物医学科学研究所动物疾病模型中心；DMEM 培养基购自中国南京凯基生物科技发展有限公司；胎牛血清（FBS）购自美国GIBCO 公司；rmIL-17A 购自美国PeproTech 公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）和人工基底膜基质凝胶Matrigel 购自美国BD 公司；Transwell 小室购自美国Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 ID8 细胞以含10%FBS 的DMEM，置于5% CO2、37℃培养箱中常规培养。

1.2.2 小鼠体内实验 将ID8 细胞注射于6 周龄雌性WT 小鼠和IL-17A-/-小鼠腹腔内（5×106/200 μL/鼠，n=6 只），6 周后颈椎脱位处死小鼠，打开腹腔，观察瘤结节生成情况，计数并拍照。

1.2.3 MTT 实验 将ID8 细胞接种于96 孔板中（4×103/100 μL/孔）。24 h 后更换培养液，加入1 ng/mL、10 ng/mL rmIL-17A，同时对照组加入等体积的生理盐水，所有组设置5个平行孔；继续培养12 h、24 h、48 h。培养结束前4 h，避光加入MTT（终浓度0.5 mg/mL）。培养结束后离心弃上清，加入DMSO（100 μL/孔），酶标仪检测波长为490 nm 的光密度值（OD490）。

1.2.4 细胞划痕实验 将ID8 细胞接种于12 孔板中（2×105/mL/孔）；待细胞贴壁后，划线，清洗去除脱落细胞；加入含2%FBS 的DMEM 培养基（1 mL/孔），加入1 ng/mL、10 ng/mL rmIL-17A，同时对照组加入等体积的生理盐水。分别于0 h、6 h、12 h、24 h 在显微镜下拍照，应用Quantity One 4.5.6 软件分析各组划痕间距。

1.2.5 Transwell 侵袭实验 将ID8 细胞接种于铺有Matrigel 胶的Transwell 上室（5×104/200 μL/孔）；在下室加入500 μL 含1%FBS 的DMEM 培养基，同时加入1 ng/mL、10 ng/mL rmIL-17A，同时对照组加入等体积的生理盐水，常规培养24 h。培养结束后，取出上室，进行漂洗，并拭去未穿膜的细胞，以4%多聚甲醛固定，用0.1%结晶紫染液染色，显微镜下拍照并统计穿膜细胞数。

1.3 统计学处理 使用GraphPad prism 5 进行统计学分析并绘图，最终结果以±s 表示。两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 内源性IL-17A 促进小鼠OvCa 腹腔内广泛生长 在接种ID8 细胞6 周后处死小鼠，结果发现，WT 小鼠腹腔内肠系膜、脾脏、肾脏表面和腹膜后淋巴结处可见密集转移灶；而IL-17A-/-小鼠腹腔内仅横膈部位有较密集转移灶，肠系膜、脾脏和肾脏表面可见极少转移灶（图1A 箭头所示）。WT 组小鼠腹腔内瘤结节数量明显高于IL-17A-/-组小鼠（56.67±5.37 vs. 14.37±3.68，P＜0.01，图1B）。

图1 内源性IL-17A 促进小鼠OvCa 腹腔内成瘤Fig 1 Endogenous IL-17A promoted tumor formation of OvCa in abdomen in mice

2.2 rmIL-17A 对ID8 细胞增殖的作用 MTT 实验结果表明，rmIL-17A 不影响ID8 细胞的增殖。如图2 所示，在0～48 h 内ID8 细胞增殖能力均呈增加趋势，但与对照组相比，不同浓度的rmIL-17A 对ID8细胞增殖没有影响（P＞0.05）。

图2 rmIL-17A 对ID8 细胞增殖的作用Fig 2 Effects of rmIL-17A on the proliferation of ID8 cells

2.3 rmIL-17A 对ID8 细胞迁移的作用 细胞划痕实验结果表明，rmIL-17A 可促进ID8 细胞迁移。如图3 所示，与对照组相比，10 ng/mL 的rmIL-17A作用6 h 后可促进ID8 细胞迁移（P＜0.05），1 ng/mL和10 ng/mL 的rmIL-17A 作用12 h 后可显著促进ID8 细胞迁移（对照组：71.67±2.62；1 ng/mL 组：50.67±2.49；10 ng/mL 组：48.00±3.74；均P＜0.01）。

图3 rmIL-17A 对ID8 细胞迁移能力的作用Fig 3 Effects of rmIL-17A on the migration of ID8 cells

2.4 rmIL-17A 对ID8细胞侵袭能力的作用 Transwell侵袭实验结果表明，rmIL-17A 可促进ID8 细胞的侵袭能力（图4A）。

图4 rmIL-17A 对ID8 细胞侵袭能力的作用Fig 4 Effects of rmIL-17A on the invasion of ID8 cells

如图4B 所示，干预24 h 后，1 ng/mL rmIL-17A 组穿膜细胞数为153.00±9.41，10 ng/mL rmIL-17A 组穿膜细胞数为169.00±10.89，而对照组仅为0.33±0.47（均P＜0.01）。

3 讨论

转移是晚期OvCa 患者死亡的主要原因之一[7-9]。但目前对OvCa 转移、侵袭的机制还不甚了解，而OvCa 细胞转移、侵袭和腹腔内生长是决定OvCa 腹腔转移的重要步骤[10-12]。本研究通过体内、体外实验研究，证实IL-17A 可以促进OvCa 的腹腔转移。

体外划痕实验表明，rmIL-17A 可以促进ID8 细胞的迁移。此外，体外的侵袭实验表明rmIL-17A 可以促进ID8 细胞的侵袭。有研究表明，IL-17A 可以通过上调基质金属蛋白酶（MMP）-2 和MMP-9 表达，增强人肺腺癌A549 细胞的侵袭能力[13]。但关于IL-17A 对OvCa 侵袭能力的影响还未见报道，需要进一步探索其机制。

本研究以相同基因背景的IL-17A-/-小鼠和WT小鼠为荷瘤动物模型，检测内源性IL-17A 对腹腔内OvCa 生长的影响。发现WT 组小鼠腹腔内瘤结节数量明显高于IL-17A-/-组小鼠，肿瘤转移灶明显多于IL-17A-/-组小鼠，表明内源性IL-17A 可以促进Ov-Ca 细胞在腹腔内的生长和转移。然而，体外MTT 实验结果表明，无论低浓度（1 ng/mL）或高浓度（10 ng/mL）的rmIL-17A 都不影响ID8 细胞的增殖。体内、外实验结果矛盾的原因，可能与IL-17A 具有促进血管生成的作用相关[14-15]。文献报道在OvCa 的组织切片中IL-17A 呈现强阳性，加速了OvCa 的血管生成[16]，而血管生成在肿瘤转移中扮演着不可或缺的角色，新生血管可以为肿瘤提供所需的营养和氧气[17]。此外，研究表明，脂肪酸结合蛋白（FABP）4 可以介导脂肪酸进入肿瘤细胞，进行β 氧化，为肿瘤细胞生长和腹腔转移提供能量[18]。本课题组以前的结果发现FABP4 是IL-17A 激活的下游效应蛋白，IL-17A可能通过促进FABP4 表达而促进脂肪酸进入肿瘤细胞发挥作用[2]，这可能是IL-17A 促进卵巢癌腹腔转移的另一个机制。

综上所述，本研究通过体内、体外研究，证实IL-17A 可以促进OvCa 的腹腔转移，为OvCa 腹腔转移的临床干预提供了新的思路和策略。