长链非编码RNA（AC073934.6）慢病毒质粒构建及其对HEY 和HeLa 细胞系SND1 表达的影响

扈利红，邱宝晨，辛灵彪，张纬

（天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津300070）

非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）是一种不编码蛋白质的RNA，通常按照其核苷酸的数量分为两类，其中长度小于200个核苷酸的称为小ncRNAs，包括微小RNAs（miRNAs）、短干扰RNAs（siRNAs）和小核仁RNAs（snoRNAs）等，而长度大于200个核苷酸的则称为长链非编码RNA（lncRNAs）。近几年的研究发现lncRNAs 在胞核和胞浆里均有功能[1]。在胞核里lncRNA 可以起到招募转录相关蛋白并识别DNA 的作用；在胞浆里通过吸附小miRNAs避免其与mRNA 结合，进而间接影响mRNA 的稳定性[2]。因此lncRNA 可以参与许多的生命活动以及疾病的发生和发展[3-5]。

长链非编码RNA AC073934.6（lncRNA-AC）是最近被鉴定出的一个不编码蛋白质的转录产物。它位于人的7 号染色体q32.1 区，长7328 bp，包含3个长度分别为340 bp、112 bp、43 bp 的外显子，但目前尚没有对其功能的研究。SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白是一个保守的多功能蛋白，前期的研究已表明，SND1 在基因转录、mRNA 剪切、mRNA 稳定性等方面发挥重要作用，进而参与细胞分化和肿瘤细胞的增殖和转移[6-10]。近期研究发现SND1 在卵巢癌中高表达，并能促进卵巢癌细胞的转移[11]。但目前为止，对于SND1 本身的表达调控机制尚不清楚。LncRNA-AC 与SND1 基因在基因组上的位置靠近，因此lncRNA-AC 可能会通过调控SND1 进而参与肿瘤的增殖和转移。本研究利用同源重组的方法构建了真核pLVX-lncRNA-AC重组质粒，并在HEY 和HeLa 两种细胞系中成功表达，探讨lncRNA-AC 与SND1 的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 慢病毒质粒载体pLVX-IRESPuro、包装质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2 由天津医科大学生物化学与分子生物学系石磊教授馈赠；DH5α 感受态大肠杆菌E.coli（BC102）购自博迈德生物公司；人肾上皮细胞293T、人卵巢癌细胞HEY、人宫颈癌细胞Hela 均来自本实验室。

1.1.2 实验试剂 限制性内切酶XhoⅠ（FD0694）和XbaⅠ（FD0684）、BCA 蛋白测定试剂盒（#SA242678）、revert aid first strand cDNA synthesis kit（K1622）均购自Thermo Fisher Scientific 公司；primestar® max DNA polymerase（R045A） 和primestar®gxl DNA polymerase（R050Q）购于Takara 公司；genbuildertmcloningkit（L00701）购自GenScript；去内毒素质粒提取试剂盒（PD1222-01）购自Biomiga；DNA 快速凝胶回收试剂盒（28704）购自QIAGEN；tripureisolationreagent（11667165001）购自Roche；trans 2K DNA marker（BM101-01）购于北京全式金公司。多克隆鼠源抗SN4 抗体为本实验室制备；辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG 二抗（120495）购自KPL；LumiGLo化学发光底物（D0018-2）购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 数据库查找lncRNA-AC 与SND1 在基因组上的位置关系 打开UCSC 数据库（http://genome.ucsc.edu/）搜索SND1 与lncRNA-AC 的位置关系。

1.2.2 目的片段的获取 收集1×106个卵巢癌细胞HEY，提取细胞基因组DNA。根据lncRNA-AC 以及真核表达质粒pLVX-IRES-Puro 的基因序列，设计出针对lncRNA-AC exon1 和exon2 的引物（F1+R1、F2+R2），并将化学合成的第3个外显子作为引物（F3+R3）（表1），引物由金唯智生物科技有限公司合成。利用同源重组的方法（图1），以基因组DNA为模板，F1+R1 为引物，扩增出含第1个外显子的DNA 片段（F1R1）；同时，通过巢式PCR 获得第2个外显子，首先以F2+R3 为引物，扩增出lncRNA-AC中包括第2个和第3个外显子的DNA 片段（F2R3），再以F2R3 为模板，F2+R2 为引物，扩增出含第2个外显子的DNA 片段（F2R2）。然后将化学合成的第3个外显子的DNA 片段（F3R3）单链经过退火变成双链。利用重叠延伸PCR，以上述3个DNA 片段为模板，F1+R3 为引物，获得目的基因（F1R3）。

1.2.3 载体与目的基因的体外连接及阳性克隆的鉴定 使用去内毒素质粒提取试剂盒提取pLVXIRES-Puro 载体，进行XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，胶回收酶切产物，把酶切产物和目的片段进行同源重组。同源重组的总反应体系是20 μL，加入目的基因、线性化的载体、同源重组试剂GenBuilder 2× Master Mix 和ddH2O。反应条件是50℃连接15 min。

表1 LncRNA-AC 的引物序列Tab 1 Primer sequences for lncRNA-AC

图1 LncRNA-AC 质粒构建示意图Fig 1 Schematic diagram of lncRNA-AC plasmid construction

重组后的产物转化至感受态大肠杆菌DH5α中，将菌液涂在含氨苄青霉素的LB 平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆，用F1+R3 引物做菌落PCR，筛选在525 bp 左右有条带的阳性菌落，大量培养，一部分菌液送金唯智生物科技有限公司进行测序鉴定，另一部分提取质粒保存备用。

1.2.4 HEY、HeLa 细胞lncRNA-AC 稳定株的构建及鉴定 包装质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2 与重组质粒按照3.95 μg：7.3 μg：11.25 μg 混匀，利用聚乙烯亚胺（PEI）共转染至融合率为70%的293T 细胞中，分别在24 h、48 h 收集病毒液并用0.45 μm滤器过滤。

待HEY、HeLa 细胞的融合率达到60%，加入9 mL病毒液，1 mL 胎牛血清和75 μg polybrene。感染48 h后更换新培养基并加入1 μg/mL 嘌呤霉素进行筛选，阳性细胞即为稳定株。取1×106稳定株细胞，用TRIzol 法提取总RNA，分别取3 μg 逆转录为cDNA，用PCR 法检测lncRNA-AC 的表达，实时荧光定量PCR检测SND1 的mRNA 水平，引物如下（表2）。同时用10 cm 皿培养细胞，随后提取总蛋白检测蛋白浓度，经8%SDS-PAGE，检测感染lncRNA-AC 之后SND1蛋白水平变化情况。

表2 LncRNA-AC 和SND1 的qPCR 引物序列Tab 2 qPCR Primer sequences for lncRNA-AC and SND1

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism7 进行统计分析。计量资料以±s 表示，组间比较采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA-AC与SND1在基因组上的位置关系 通过数据库发现，lncRNA-AC 的转录起始位点和SND1 的转录起始位点之间仅有168 bp，与SND1转录方向相反，AC073934.6 位于SND1 基因反义链（图2）。

2.2 LncRNA-AC 基因片段获取 以基因组DNA为模板，成功获得lncRNA-AC 的基因片段F1R1、F2R2 和F1R3（图3）。

图2 LncRNA-AC 和SND1 基因的位置关系Fig 2 Positional relationship of lncRNA-AC and SND1

图3 LncRNA-AC 的目的片段Fig 3 Target fragment of lncRNA-AC

2.3 载体与目的基因的体外连接及阳性克隆的鉴定 采用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切pLVX-IRES-Puro得到线性化的载体，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定及回收（图4）。

图4 线性pLVX-IRES-Puro 质粒载体的获取Fig 4 Acquisition of linear pLVX-IRES-Puro plasmid vector

菌落PCR 结果显示，1 号克隆含有阳性重组质粒（图5）。测序结果显示重组质粒的序列与lncRNA-AC 序列完全一致（图6）。这些结果表明pLVXIRES-lncRNA-AC 质粒构建成功。

图5 菌落PCR 筛选阳性重组体Fig 5 Bacterial PCR screening for positive recombinants

2.4 HEY、HeLa 细胞lncRNA-AC 稳定株的构建及SND1 表达量的测定 普通PCR 扩增lncRNA-AC，经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定lncRNA-AC 在细胞中成功转录（图7）。

图6 重组质粒lncRNA-AC 的测序结果Fig 6 Sequencing results of recombinant plasmid lncRNA-AC

图7 过表达lncRNA-AC 稳定株的PCR 结果Fig 7 PCR of lncRNA-AC overexpressing stable strain

在HEY 和HeLa 细胞中，通过Western 印迹检测，lncRNA-AC 的过表达几乎不影响SND1 的蛋白质水平（图8A）。同时，利用实时PCR 检测了HEY和HeLa 细胞中过表达lncRNA-AC 后SND1 的mRNA 水平。在HEY 细胞系中，WT 和过表达lncRNA-AC 后SND1 的mRNA 相对表达量分别为1.00±0.14 和1.24±0.19，差异无统计学意义（t=1.761，P=0.07）；在HeLa 细胞系中，两者的表达量分别为1.02±0.09 和0.83±0.13（t=2.081，P=0.14），差异无统计学意义（图8B）。

图8 LncRNA-AC 不影响SND1 的表达Fig 8 LncRNA-AC does not affect the expression of SND1

3 讨论

本研究采用了多种PCR 衍生技术成功构建了重组质粒lncRNA-AC。为了获得特异的F2R2，采用了巢式PCR。巢式PCR 的目的是使用两对PCR 引物扩增特异的片段。第一对PCR 引物又称外侧引物，扩增相对大的区域；第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR 产物内部，从而获得特异性的目的片段。其次，采用了重叠延伸PCR 将lncRNA-AC的3个外显子片段（F1R1、F2R2 和F3R3）连接起来。重叠延伸PCR 可作为位点定向突变的手段，为目的基因引入所需的突变[12-13]。最终，通过同源重组的方法把lncRNA-AC 的编码片段和线性化载体连接起来。同源重组构建质粒的关键是每个DNA 片段（包括克隆载体）末端需含有一个15～40 bp 的共享同源序列作为同源臂，含有相同同源臂的两个片段可以在重组酶的作用下特异性连接。因此，同源重组是目前高效快速构建质粒的策略[14-15]。在本次研究中，通过巢式PCR、重叠延伸PCR 和同源重组法成功构建了lncRNA-AC 的慢病毒质粒。

LncRNA-AC 与SND1 的转录起始位点只相差168 bp，且转录方向相反，它们共用了一段转录启动序列。但是，在HEY 和HeLa 细胞中过表达lncRNA-AC 并不影响SND1 的表达。提示在卵巢癌细胞系中lncRNA-AC 可能不会形成二级结构招募蛋白并结合至SND1 的启动子去影响SND1 的表达。LncRNA-AC 在HEY 细胞和HeLa 细胞中几乎不表达，但SND1 的表达量均比较高。这可能是由于lncRNA-AC 与SND1 的转录方向相反，发生转录碰撞，随后SND1 的转录活性占主导所致。然而有趣的是，在数据库中发现lncRNA-AC 和SND1 均在肝、垂体和睾丸等中高表达。提示在肝、垂体和睾丸中可能存在着不同于细胞系中的组织特异性的表达调控机制。但是，目前还没有在小鼠基因组中找到人源lncRNA-AC 的同系转录本或者转录类似物。因此需要继续在人源的肝细胞系中探讨lncRNAAC 与SND1 的表达关系。