广东省大豆种质资源遗传多样性分析及DNA分子身份证构建

李 清，罗永坚,2，吴柔贤，贾俊婷，张文虎，宋松泉，刘 军

（1.广东省农业科学院农业生物基因研究中心/广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室，广东 广州 510640；2. 湖北民族大学林学园艺学院，湖北 恩施 445000）

【研究意义】大豆起源于中国，栽种历史悠久，地理分布广泛，兼具粮食作物和经济作物的双重价值，是我国农业生产重要的农业产品［1-2］。因此，大豆种质资源的遗传多样性分析和种质资源创新利用具有重要意义。【前人研究进展】目前，在大豆种质资源遗传多样性研究中，SSR分子标记技术应用较广泛［3-4］。DNA分子身份证技术以SSR分子标记技术为基础，通过对SSR扩增多态性结果分析并进行数字化编码赋值，得到独一无二的数字编码作为DNA分子身份证，具有准确性高、快速简便的优点，对种质资源的知识产权保护具有重要作用［5］。目前，植物DNA分子身份证已广泛应用于品种保护和种质资源鉴定中。唐玉娟等［6］对34 份广东夏大豆材料进行了SSR检测，并利用5个SSR引物构建其分子身份证，为广东夏大豆品种的鉴定提供了依据。Zhang等［7］用SSR分子标记对中黄18、中黄68、中黄35、中黄13和菏豆13等5个大豆栽培种进行检测，构建了进化树，并进行了主成分分析，发现中黄18、中黄68、中黄35之间存在较大差异，而中黄13与菏豆13的亲缘性较高。基于DNA分子身份证的广泛应用和高通量测序的快速发展［8］，田志喜团队［9-10］从2 898份大豆种质中筛选了26个野生和栽培大豆，进行了遗传多样性分析和泛基因组学研究，构建进化树并挖掘得到与性状相关的重要基因，对育种具有重要意义。

【本研究切入点】光热资源丰富、雨水充足的华南地区是大豆生产最具发展潜力的地区之一［11-12］。广东省大豆品种资源丰富，但目前有关该地区大豆遗传多样性及DNA分子身份证的研究报道不多［6,13-14］，涉及的品种数量太少。此外，对广东省农家种大豆的品种来源和性状鉴定方面的信息收集相对较少。【拟解决的关键问题】鉴于此，本研究采用30对SSR分子标记对收集的96份广东大豆农家种资源进行遗传多样性分析，初步确定大豆资源的亲缘关系，筛选核心引物并构建DNA分子身份证体系，以期为广东省大豆种质资源遗传评价、资源保护及创新利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试96份大豆材料为幼苗期叶片，由广东省农业科学院农业生物基因研究中心于全国第三次资源调查活动中从广东省19个市37个县市收集得到，样品采集信息见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 选用CTAB法［15］提取植株DNA，采集幼苗期10株大豆叶片混合提取DNA并进行电泳检测DNA质量，DNA保存于-20℃。

1.2.2 PCR扩增 大豆引物（表2）来源于Soybase数 据 库（http://soybase.org/resources/ssr.php）， 以等位变异片段≥3，扩增效率高，引物特异性好以及具有多态性为标准进行预筛选，从中得到了30对SSR引物，所用引物均由阅微基因技术有限公司合成。PCR扩增体系为10 μL，其中10×Buffer 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，Primer Mix（5 μmol/L），正、反 SSR引物各0.6 μL，HSTaq（5U/μL）0.1 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O补齐至10 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、60℃退火30 s、72 ℃延伸 30 s，35个循环；72℃延伸 5 min，4℃保存。

1.2.3 PCR产物毛细管电泳检测及数据分析 于96孔板中每孔加入ROX-500分子量内标0.5 μL和甲酰胺混合液8.5 μL，混匀后加入1 μL 经纯化后的PCR产物，然后使用ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳检测。待电泳结束后，利用Genemapper 3.2软件自动生成每个位点的图谱文件，分析扩增片段峰值，读取扩增片段大小。

根据一个引物一个基因位点，将不同引物不同资源电泳片段大小录入到EXCEL中，用DataFormate2.7软件转化成POPGENE软件所要求的格式后，使用该软件分析计算等位变异片段数（A）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和Shannon 信息指数（I）。采用DataFormate2.7软件对电泳数据进行转化为“0”“1”格式二元矩阵，使用NTSYS-PC 2.1软件计算遗传距离矩阵［16］，使用MEGA7软件进行聚类分析构建NJ系统树状图，并使用在线软件iTOL（https://itol.embl.de/）优化。

1.2.4 DNA分子身份证构建 大豆种质资源SSR分子身份证的编码，采用数字和字母表示，具体方法如下：根据每对引物扩增片段（等位变异片段）从小到大以阿拉伯数字1～9标注，9个以上的等位变异片段，以大写英文字母A～Z 标注，若该位点在某个资源中无扩增记为0；每个引物位点占两位，构建成数字与字母相结合的DNA分子身份证。将身份证编码录入条形码生成器（http://www.t-x-m.com/）构建条形码身份证。将大豆的基本信息、形态特征、生长特征、品质数据、DNA身份证编码等文本信息录入二维码生成器（https://cli.im/），生成可供扫描的大豆DNA身份证二维码。

表1 供试大豆资源信息Table 1 Information of 96 soybean resources

表2 SSR引物序列Table 2 List of 30 SSR primers

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

利用PCR扩增后的产物经荧光毛细管电泳后，准确获取每对引物在不同材料的DNA片段大小和相应的毛细管电泳图。由表3可知，采用30对引物对96份大豆共扩增出273个多态性等位变异片段，平均每对引物扩增出14.29个多态性等位变异片段。其中，引物Sat_258扩增出的等位变异片段最多（23.0个）；引物Satt619、Satt256和Satt703扩增出的等位变异片段最少（4.0个）。30对引物检测到等位变异片段数（Na）共273个，平均每对引物扩增出多态性等位变异片段9.1个。Nei’s多样性指数（H）的变化范围为0.4324～0.9348，平均值为0.7133；Shannon 信息指数（I）的变化范围为0.8007～2.8763，平均值为1.5893；期望杂合度（He）的变化范围为0.4345～0.9348，平均值为0.7138；多态性信息含量（PIC）的范围为0.3891～0.9310，平均值为0.6786。一般认为，当PIC＞0.50时可以认为该引物为高度多态性信息引物［17］。因此，所选的大部分引物为高度多态性信息引物，说明这些引物可用于大豆种质资源的鉴定和研究。

2.2 聚类分析

根据30对引物在96个大豆资源的多态性片段信息建立数据矩阵，由NTSYSpc 2.1e软件用UPGMA的算法计算遗传距离矩阵，然后采用MEGA7的Neighbour-joining算法构建系统发生树［16］，结果表明，96份大豆资源可以划分为3个类群（图1），第一个组类群包含47份大豆资源，第二个组类群包含32份大豆资源，第三个组类群包含17份大豆资源。结合聚类结果和原产地分析发现，3个组群同一地理来源的资源并没有完全聚在一起，不同地区来源的资源发生了聚类，这说明收集的96份广东省农家种大豆具有品种多样性，各类群品种之间亲缘关系较近，遗传差异较小。

2.3 核心引物的构建

构建DNA分子身份证的最终目的是使用最少的SSR标记引物达到区分所收集的农家种大豆种质资源并赋予其可辨的分子身份证，同时选取的SSR引物需要满足能区分最多大豆种质的原则。存在特异性位点的材料能通过单一的引物即可直接鉴定，但一般存在于少量的品种中。为了区分尽可能多的材料，通常采用多引物组合，直至将所有材料完全区分开。以30对引物的PIC指数（表3）为标准；选用PIC最高的引物开始筛选供试资源，再加入PIC第二高的引物组合；以此类推，直至筛选出可将全部供试大豆种质全部区分的引物组合，结果见表4。通过PIC由高到低组合，发现在30对SSR引物中用9对引物即可完全分离96份大豆。基于最少引物区分最多种质的原则，对9对引物进行精简化，将分离种质数目较低的Satt197、Satt547、AZ302047引物在9对引物中剔除，发现Sat_258、Sat_351、Satt540、BE806308、Sat_164、Satt346 共6对引物组合即可将96个大豆资源完全区分。

为验证上述6对引物分离96份大豆的可行性，根据这6对SSR引物的等位变异系数分别为23、16、11、13、17、8，按照引物组合能区分最多品种数 A=N1N2N3… Nn（N1、N2、N3… Nn为每对引物的观测等位变异片段数Na）的理论值计算，结果表明6对SSR引物组合能够区分最大品种数目的理论值为7 156 864个。因此该6对SSR引物可作为核心引物用于96份大豆DNA指纹图谱身份证的构建。

2.4 大豆DNA分子身份证编码

采用上述6对核心引物构建了96份大豆资源的DNA分子身份证（表5）；进一步将DNA身份证导入条形码生成器，将大豆的资源信息、特征特性、产量表现、栽种措施及DNA身份证编码等文本信息录入二维码生成器，成功构建了96份广东大豆资源的DNA身份证二维码。图2为第43号大豆资源的DNA身份证结果示例。

3 讨论

SSR分子标记作为稳定、高效且多态性好的种质资源鉴评方法［18］，有助于分析大豆的亲缘关系与遗传多样性，并被广泛应用于大豆种质资源鉴评研究中［19］。本研究利用30对扩增效果清晰、稳定的SSR引物检测96份广东省农家种大豆资源，结果显示平均等位变异片段数（Na）为9.1个，平均有效等位变异片段数（Ne）为4.2657个，Nei’s多样性指数（H）平均值为0.7133，Shannon 信息指数（I）平均值为1.5893，期望杂合度（He）平均值为0.7138，多态性信息含量（PIC）平均值为0.6786。根据30对SSR引物在96份广东省农家种大豆资源中的多态性结果进行亲缘关系分析发现，供试大豆资源可以分为3个类群，这3个类群并不完全依据地理划分，聚类分析结果并不能用以判定品种的来源地，但该亲缘关系说明所收集的96份农家种大豆具有资源多样性，达到了广泛收集农家品种的目的，为广东省大豆品种选育积累了丰富的种质资源。

表3 30对SSR在96份大豆的遗传信息统计Table 3 Genetic information statistics of 30 SSR pairs in 96 soybean resources

图1 96份大豆样品基于遗传距离的Neighbour-joining系统发生树Fig. 1 Neighbour-joining phylogenetic tree of 96 soybean resources based on genetic distance

本研究通过对96份大豆进行遗传多样性和亲缘性分析，以PIC为指标对30对引物进行筛选，剔除分离率较低以及相似性过高的引物，得到可区分96份大豆的6对核心引物组合：Sat_258、Sat_351、Satt540、BE806308、Sat_164、Satt346。第三次全国农作物种质资源普查与收集过程中，我们已经收集了大量的大豆地方品种，为避免后期重复收集，可将这些核心引物应用于种质资源的甄别工作，推进种质资源的鉴评和利用。符小发等［20］通过对大豆品种的产量、成熟期、分枝等农艺性状进行鉴评，利用聚类分析得到了产量相关的主成分因子。孔凡江团队利用基因组学与生物信息学，发掘了野生大豆开花驯化过程中的关键调控因子Tof11和Tof12［21-22］。因此，可以对收集到的大豆资源开展SSR分子标记与农艺性状相关研究的同时，结合基因组学、生物信息学等方法，进一步挖掘大豆农艺性状的关键影响因子。同时核心引物也能对广东省农家种大豆进行快速的指纹图谱构建，对应相关DNA分子身份证信息以及鉴评性状，为广东省农家种大豆资源的保护提供有力支撑。本研究将DNA身份证导入条形码生成器，录入相关资源信息，成功构建数字化的96份大豆资源DNA身份证。将所得到的数据转化为可视化的信息进行普及，不仅丰富了种质资源信息数据库，也为种质资源的保护和创新利用奠定了重要基础。同时，大豆资源DNA分子身份证的构建也有利于农户的大豆生产相关栽培知识的宣传，对大豆资源的保护与规范化种植具有促进作用。

表4 有效SSR标记引物组合对大豆资源的区分Table 4 Identification of soybean resources by effective SSR marker primer combinations

表5 96份大豆资源的分子身份证编码Table 5 Molecular ID of 96 soybean landraces

图2 第43号大豆资源DNA身份证条形码和二维码身份证Fig. 2 DNA ID barcode and QR code ID of No. 43 soybean resources

4 结论

本研究收集了广东省19个市37个县市共96份农家种大豆种质资源，利用30对SSR引物进行检测获得相关多态性结果，通过聚类分析发现该96份大豆品种具有资源多样性，并且可以分为3个类群。对30对SSR引物进行筛选后得到6对核心引物，基于该6对SSR引物的多态性结果构建了供试大豆的DNA分子身份证，进一步记录相关品种性状并转化为可视化信息，为广东省大豆种质资源的保护与鉴评积累了基础，也为大豆品种的推广与利用提供了重要依据。