维生素C对昆明裂腹鱼幼鱼抗乐果胁迫能力的影响

杨通枝，詹会祥，姚俊杰，杨 梅，韦玉来，杨龙保

( 1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2.毕节市水产技术推广站，贵州 毕节 551700 )

鱼类早期发育阶段在整个生活史中最为脆弱，决定其个体存活率，存活率的高低对资源补充有直接影响，幼鱼为鱼类生活史的重要阶段，此阶段器官已形成，但尚未发育完全。昆明裂腹鱼(Schizothoraxgrahami)是我国特有的高原鱼类，被列为贵州省重点保护鱼类之一[1]，养殖过程中其幼鱼成活率受各种因素的影响。乐果是一种传统的有机磷内吸性杀虫剂和触杀性杀螨剂，作为外围因子，进入鱼体会影响其正常生理功能，造成大量自由基的产生，引起机体损伤，影响其正常生长[2]。7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶能催化农药在生物体内的降解[3]，伴随产生的自由基由过氧化氢酶清除[4-5]，过氧化氢酶是机体重要的抗氧化酶，脂质过氧化最主要的代谢产物为丙二醛，均可作为机体受损伤程度的指标[6]。乙酰胆碱酯酶活性能反映农药是否具有神经毒性。热休克蛋白(HSPs)在整个生物界中广泛存在，是一类在生物体中与应激相关的十分重要的蛋白，能对环境应激产生应答，在正常情况下，表达量小或者不表达，作为分子伴侣参与细胞凋亡、蛋白质代谢和细胞周期调控等生理过程。可以抑制产生氧自由基的关键酶NADPH氧化酶，其通过反馈作用减少氧自由基的产生，还可增加内源性过氧化氢酶活性。在生物体遇到低氧、高温、饥饿等刺激时，HSP70 mRNA表达就会显著增加，增大生物体对不良刺激的耐性，从而维持内环境和细胞生存[7]。HSP70基因是热休克蛋白最保守的家族基因，发生细胞应激后，反应快速、明显，具有维持细胞结构稳定以及提高对应激原的耐受性等作用[8]。Yar Ahmadi等[9]研究表明，HSP70 mRNA的表达刺激免疫应答，提高自身疾病抵抗。

维生素C是一种水溶性抗氧化剂，可清除氧自由基、保护细胞免受氧化损伤，在促进鱼类生长、缓解应激胁迫和创伤愈合方面有明显作用[10-13]。研究表明，饲料中维生素C含量的增加会促进血清总抗氧化能力的上升[14]，在孵化水体中添加适宜剂量的维生素C能提高胚胎期的抗氧化能力[15]，维生素C增加鱼体内不同组织HSP70 mRNA表达[16-17]，且90 mg/L维生素C对匙吻鲟(Polyodonspathula)仔鱼抗氧化有较好的保护作用[18]。

笔者以昆明裂腹鱼幼鱼为研究对象，探究其在乐果作用下，不同组织中7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶、过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶的活性和丙二醛含量以及肌肉中HSP70 mRNA的表达情况，进一步探究维生素C对其毒性的解胁迫效果，以期为昆明裂腹鱼幼鱼的养殖培育提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

昆明裂腹鱼幼鱼由贵州省毕节市鑫有农业综合开发有限责任公司双坪基地提供，选用规格一致、健康活泼，无病、无伤、无畸形的昆明裂腹鱼幼鱼，试验鱼体长(4.35±0.27) cm，体质量(1.52±0.26) g。暂养于实验基地中驯养2周，驯养期间，其行为、摄食正常，无并发症，死亡率<1%。试验前24 h停止投食。

试验用水为该基地养殖场所用山泉水，水温(13.5±0.5) ℃，pH 6.0，溶解氧≥5.0 mg/L，氨氮<0.2 mg/L，亚硝态氮<0.005 mg/L。

试验用乐果有效成分含量40%，为杀虫剂，购自广西汇丰生物科技有限公司。维生素C购自上海豪申化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计与样品的采集

根据前期试验可知，乐果96 h半致死质量浓度为39.598 mg/L，安全质量浓度为10.182 mg/L。将乐果分5个组进行试验，分别为1个对照组和4个试验组，每组3个平行。乐果的质量浓度分别为：0(对照组)、5.091、10.182、24.890、39.598 mg/L，各组持续染毒120 h，且在第96 h采样后在各试验组水体中加入90 mg/L维生素C，每12 h换水1/3。分别于0、24、48、96、120 h时，每组取10尾昆明裂腹鱼幼鱼，每尾鱼取肌肉、肝脏和鳃组织，经0.85%的生理盐水润洗，滤纸吸干表面水分后迅速投入2 mL离心管中，于冰箱-20 ℃保存，用于酶活性的测定。另取肌肉置于装有5～10倍体积的RNA保存液的离心管中，4 ℃放置1 d，待RNA保存液充分浸入组织，再置于-20 ℃保存，用于基因克隆及表达的测定。

1.2.2 酶液制备及酶活性测定

称取对应组织样品，加入预冷的10倍体积(m/V)的0.85%生理盐水(等渗)，在冰浴条件下用匀浆器对组织进行匀浆，2500 r/min离心10 min，取上清液于冰箱4 ℃保存，用于酶活测定，且在24 h内测定完毕，否则重制。

采用考马斯亮蓝法测定酶液蛋白浓度，7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶测试盒购自江莱生物，乙酰胆碱酯酶测试盒购自艾美捷科技，过氧化氢酶和丙二醛测试盒购自南京建成生物技术有限公司，均按其说明书进行测定。

1.2.3 实时定量PCR标准曲线的建立及HSP70 mRNA的定量测定

在GenBank中查找收录的裂腹鱼近缘物种齐口裂腹鱼(S.prenanti)HSP70的保守序列，运用 Primer 5.0、Editseq和Primerselect软件设计特异性引物，选取肌动蛋白(β-actin)基因作为实时荧光定量PCR的内参基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，其参数见表1。

表1 引物序列及扩增片段大小Tab.1 Sequences and amplified fragment size of the primer used in the experiment

采用动物组织RNA提取试剂盒(康为世纪)对昆明裂腹鱼幼鱼的肌肉组织进行总RNA提取，用cDNA反转录试剂盒(康为世纪)对总RNA反转录成cDNA，对cDNA作10倍稀释，用于制作目的基因和内参基因的标准曲线。以稀释后的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR反应体系(10 μL)：2×Talent qPCR preMix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 2 μL，模板2 μL。反应条件：95 ℃下预变性5 min；95 ℃下变性30 s，55 ℃退火温度30 s，72 ℃下延伸1 min，共进行30个循环。

1.3 数据处理

数据用SPSS 19.0软件处理，利用单因素方差分析和Duncan多重比较，结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。按照相对比较Ct法(2-△△Ct)计算目的基因的相对表达情况。△Ct为目的基因Ct与内参基因Ct的差值，△△Ct为各处理组△Ct与正常组的△Ct的差值，2-△△Ct为试验组目的基因的表达相对于对照组变化的倍数。

2 结 果

2.1 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶的影响及维生素C的解胁迫作用

昆明裂腹鱼幼鱼不同组织7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶活性变化见图1。肝脏第24 h各试验组7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶均显著上升(P<0.05)，且39.598 mg/L试验组活性最高，为开始的3.44倍；48 h，10.182、24.890、39.598 mg/L试验组均显著下降(P<0.05)，对照组和5.091 mg/L试验组均显著上升(P<0.05)；96 h所有试验组均显著下降(P<0.05)；120 h除对照组外，其余试验组均不同程度显著上升，质量浓度由低到高各组7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶活性分别上升了1.06、1.05、1.02、1.06倍。

肌肉中7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶活性第24 h除对照组外均显著上升(P<0.05)，48 h均显著下降(P<0.05)，96 h 39.598 mg/L试验组仍显著下降(P<0.05)，120 h，质量浓度由低到高各组7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶活性分别上升了1.04、1.05、1.07、1.04和1.02倍。

鳃中7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶活性第24 h除对照组外均显著上升(P<0.05)，24.890、39.598 mg/L试验组分别增长了2.82和3.44倍，5.091、10.182 mg/L试验组活性分别上升了1.21和2.28倍；48 h 39.598 mg/L试验组活性显著下降(P<0.05)，其他各组活性均显著上升，24.890 mg/L试验组活性达最大；96 h均显著下降，39.598 mg/L试验组活性低于对照组；120 h 39.598 mg/L试验组活性持续降低，其他组活性均不同程度升高。

图1 昆明裂腹鱼幼鱼不同组织中7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶活性随日龄变化情况Fig.1 Changes in EROD activities in different tissues of juvenile S. grahami with age in days图中同一处理组中，不同字母表示不同试验组间差异显著(P<0.05)，相同字母表示无显著差异(P>0.05)，各组织0 h自上而下的字母分别对应39.598、24.89、10.182、5.091 mg/L，对照组，下同.Means with different letters in the same treatment group are significant differences among test groups (P<0.05), and means with the same letter are no significant differences (P>0.05); the letters from the top to the bottom in each tissue for 0 h correspond to 39.598 mg/L, 24.89 mg/L, 10.182 mg/L, 5.091 mg/L and that in control group, respectively; et sequentia.

2.2 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼过氧化氢酶的影响及维生素C的解胁迫作用

昆明裂腹鱼幼鱼不同组织过氧化氢酶活性变化见图2。肝脏过氧化氢酶活性24 h除对照组，其他试验组均显著上升(P<0.05)，且39.598 mg/L试验组活性最高，为0 h的9.46倍，为24.890 mg/L试验组的5.11倍；48 h 39.598 mg/L试验组活性显著下降(P<0.05)，24.890 mg/L试验组活性上升，其他组活性上升；96 h除对照组外，各组活性均下降，10.182 mg/L试验组活性达最大，39.598 mg/L试验组活性低于对照组；120 h各组活性持续下降。

图2 昆明裂腹鱼幼鱼不同组织中过氧化氢酶活性随日龄变化情况Fig.2 Changes in CAT activities in different tissues of juvenile S. grahami with age in days

肌肉过氧化氢酶活性24 h 39.598 mg/L试验组活性最高，为0 h的5.5倍，为24.890 mg/L试验组的3.64倍；48 h 39.598 mg/L试验组活性显著下降(P<0.05)，24.890 mg/L试验组活性上升，5.091、10.182 mg/L试验组活性显著上升(P<0.05)；96 h 39.598 mg/L试验组活性低于对照组，其他3组的活性仍持续上升；120 h除对照组，各组过氧化氢酶的活性不同程度下降。

鳃的过氧化氢酶活性第24 h 39.598 mg/L试验组活性最高为0 h的1.82倍；48 h 39.598 mg/L试验组活性显著下降(P<0.05)，24.890 mg/L试验组活性上升，但仍小于39.598 mg/L试验组的活性；96 h各组的活性均下降，39.598 mg/L试验组的活性低于对照组；120 h除对照组，各组过氧化氢酶的活性不同程度下降。

2.3 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼丙二醛的影响及维生素C的解胁迫作用

昆明裂腹鱼幼鱼不同组织丙二醛含量变化见图3。肝脏丙二醛含量24 h 24.890、39.598 mg/L试验组含量分别上升了6.44和8.59倍；48 h含量均下降，但24.890试验组含量达最高，高于39.598 mg/L试验组；96 h 24.890 mg/L试验组含量下降，其余组均上升，39.598 mg/L试验组含量达最高；120 h各组丙二醛含量均不同程度下降。

肌肉24 h 24.890、39.598 mg/L试验组丙二醛含量分别为0 h的10.5和12.75倍；48 h各组含量均显著下降(P<0.05)；96 h各组含量均不同程度上升；120 h除对照组，各组丙二醛含量均不同程度下降。整体含量变化较为一致。

鳃24 h 24.890、39.598 mg/L试验组丙二醛含量分别为0 h的7.96和11.15倍；48 h 39.598 mg/L试验组含量显著下降(P<0.05)，24.890 mg/L试验组含量上升，高于39.598 mg/L试验组；96 h上述两组含量显著升高(P<0.05)，39.598 mg/L试验组含量再次达最高；120 h除对照组，各组丙二醛含量不同程度下降，但24.890、39.598 mg/L试验组含量仍较高。

2.4 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼乙酰胆碱酯酶的影响及维生素C的解胁迫作用

昆明裂腹鱼幼鱼不同组织乙酰胆碱酯酶活性变化见图4。肝脏乙酰胆碱酯酶活性24 h 24.890、39.598 mg/L试验组活性分别上升了2.82和3.44倍；48 h活性均下降，24.890 mg/L试验组活性达最大；96 h 24.890、39.598 mg/L试验组活性显著下降(P<0.05)，5.091、10.182 mg/L试验组活性显著上升(P<0.05)；120 h各组乙酰胆碱酯酶的活性均不同程度下降，39.598 mg/L试验组低于对照组。

肌肉的乙酰胆碱酯酶活性24 h 39.598 mg/L试验组为0 h的6.58倍；48 h各组活性均显著下降(P<0.05)；96 h各组活性再次上升；120 h均显著下降(P<0.05)。各组乙酰胆碱酯酶的活性随时间变化较为一致。

图3 昆明裂腹鱼幼鱼不同组织中丙二醛含量随日龄变化情况Fig.3 Changes in MDA levels in different tissues of juvenile S. grahami with age in days

鳃的乙酰胆碱酯酶活性24 h 24.890、39.598 mg/L试验组活性分别为0 h的3.83和4.96倍；其随时间变化情况与肌肉较为一致。

图4 昆明裂腹鱼幼鱼不同组织中乙酰胆碱酯酶活性随日龄变化情况Fig.4 Changes of AchE activities in different tissues of juvenile S. grahami with age in days

2.5 乐果胁迫下昆明裂腹鱼幼鱼HSP70 mRNA的表达及维生素C的影响

乐果胁迫下昆明裂腹鱼幼鱼HSP70 mRNA的表达及维生素C的影响见图5。不同质量浓度乐果诱导下HSP70 mRNA水平显著表达(P<0.05)，随着胁迫时间的延长，由24 h至96 h，除39.598 mg/L试验组外，其余各组变化均不显著(P>0.05)，120 h在添加维生素C后各组HSP70 mRNA表达水平均显著下降(P<0.05)，5.091、10.182 mg/L试验组的表达水平接近对照组。

图5 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼HSP70 mRNA相对表达量的影响及维生素C作用的变化Fig.5 Effect of dimethoate on the relative expression level of HSP70 mRNA and the effect of VC on the relative expression level of dimethoate in juvenile S. grahami

3 讨 论

3.1 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼不同组织7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶活性的影响及维生素C对该影响的作用

7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶是细胞色素氧化酶P450中同工酶CYP1A1的一族，可被诱导参与外源物质的降解反应，作为外源污染物的生物标志物[19]，在监测水质对于水产动物生理影响的指标中具有一定的代表性作用。本试验中，38.598 mg/L(96 h半致死质量浓度)的乐果试验组对昆明裂腹鱼幼鱼7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶的诱导均显著大于10.182 mg/L(安全质量浓度)试验组，表现出剂量—效应关系，即指一种外来化合物剂量与个体或群体呈现某种效应的定量强度，或平均定量强度之间的关系。同时，乐果对鳃中7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶的诱导作用最大，其次为肝脏，对肌肉的诱导作用最小，且对3种不同组织7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶的诱导均表现出随时间的延长呈现先升后降的变化趋势，在添加维生素C后又出现升高的现象，但鳃组织中38.598 mg/L试验组的7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶活性无法恢复。这可能是因为乐果进入水体，直接作用于昆明裂腹鱼幼鱼的鳃组织，对其作用最强，导致其被损坏，无法再正常参与生命活动。而肝脏是生物体主要内源和外源污染物的解毒代谢组织，其具有相对肌肉更强的解毒代谢功能[20]。添加维生素C后，7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶活性升高，说明维生素C能在一定程度上促进机体对农药等外源物质的降解水平，提高机体耐药性。

3.2 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼不同组织过氧化氢酶活性的影响及维生素C对该影响的作用

7-乙氧基试卤灵—脱乙基酶降解农药的过程中，伴随着大量自由基的产生，自由基在体内蓄积，将导致机体损伤，使生命体出现病理症状[21]。保持自由基处于动态平衡的稳定状态需综合外源和内源两种因素的作用[22]。生物体内的抗氧化酶防御系统在清除活性氧过程中产生过氧化氢，过氧化氢酶自身分解过氧化物自由基，能将过氧化氢转化成水[4-5]，排出体外，避免机体损伤。本试验中，过氧化氢酶活性亦表现出剂量—效应关系，其在肝脏、肌肉和鳃中均被大量诱导，且在肝脏中诱导倍数最大，而鳃的诱导基数最大，这可能是因为乐果进入鱼体后，直接作用于鳃组织，导致其活性较高，而肝脏主要为解毒代谢器官，其产生的大量自由基释放于肌肉组织中，导致肌肉中过氧化氢酶活性增高，但肝脏也是乐果直接攻击受体，损伤程度大于肌肉，在一定程度上丧失解毒功能，表现出过氧化氢酶活性降低，此时肌肉承担了清除自由基的主要作用，96 h的过氧化氢酶活性上升。添加维生素C后，各组过氧化氢酶活性显著降低，说明维生素C对机体清除自由基起到了一定的辅助作用，减轻了过氧化氢酶的负担，使过氧化氢酶活性降低，这与秦国兵等[18]的研究结果一致。

3.3 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼不同组织丙二醛活性的影响及维生素C对该影响的作用

自由基在体内积累到一定程度，会导致脂质过氧化，脂质过氧化程度可通过丙二醛含量体现，其水平高低能够代表脂质过氧化强度和速率，反映机体氧化损伤程度[6]。本试验结果表明，鳃中脂质过氧化程度最大，肌肉中最小，说明鳃中自由基积累程度最高，这可能是因为乐果直接作用于昆明裂腹鱼幼鱼鳃组织后，短时间内自由基无法得到清除而发生脂质过氧化。48 h机体应激反应强烈，自由基被大量清除，经过适应阶段后，96 h脂质过氧化不同程度升高。添加外源维生素C后，自由基得到内外双重作用的清除，积累量少，脂质过氧化程度低。说明维生素C可以直接参与机体内过量自由基的清除，从而保护组织免受自由基过氧化作用损伤[23]。明建华等[24-25]等对维生素C抗应激方面的研究也都得到了相似的结论。姜亚军等[26]的研究也表明，维生素C能有效捕捉和清除自由基，防止或阻断自由基引发的氧化反应，参与调节抗氧化酶活性，增强机体对自由基的清除能力。

3.4 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼不同组织乙酰胆碱酯酶活性的影响及维生素C对该影响的作用

有机磷农药进入鱼体后，会抑制其乙酰胆碱酯酶活性[27]，而乙酰胆碱酯酶主要存在于神经组织和血细胞中，因此，乙酰胆碱酯酶的活性变化可反映外源物质是否对机体造成神经毒性。本试验中，乐果对昆明裂腹鱼具有神经毒性，且在鳃中毒性最大，因为乐果进入鱼体，直接导致鳃组织遭受破坏，影响气体交换，呼吸器官肌肉麻痹，流量降低后造成机体处于缺氧状态[28]。急、慢性缺氧均可导致斑马鱼(Daniorerio)幼鱼脑组织产生氧化应激损伤[29]，造成神经毒性。昆明裂腹鱼幼鱼肌肉中较高的乙酰胆碱酯酶活性，表明肌肉组织中的乙酰胆碱酯酶也是有机磷农药结合的靶酶，这与齐红莉等[30]的研究结果一致。而肝脏中乙酰胆碱酯酶活性相对较低，说明乐果对肝组织亦造成了损伤，但对其敏感性低于鳃和肌肉组织，所以昆明裂腹鱼幼鱼的鳃和肌肉组织中乙酰胆碱酯酶活性高低可以作为衡量水体环境中有机污染物对其造成影响程度的指标。添加维生素C后，不同组织各试验组的乙酰胆碱酯酶活性均显著降低，说明维生素C在缓解有机磷对鱼类神经损伤方面发挥了积极作用，但具体作用机理有待进一步研究。

3.5 乐果对昆明裂腹鱼幼鱼肌肉组织HSP70 mRNA表达的影响及维生素C对该影响的作用

HSP70 mRNA在一般情况下不表达或表达量少，在受到外界胁迫时，生物体内的HSP70 mRNA会显著表达，增加生物体对不良刺激的耐受性，从而维持内环境稳定和正常的生理活动[7]。试验表明，乐果能在短时间内引起神经胶质U87瘤细胞HSP70 mRNA表达的显著变化，并存在一定的剂量—效应关系[31]。杨东仁等[32]的研究也表明，乐果作用后可使机体HSP70 mRNA表达增加。HSP70 mRNA表达量升高能增强生物体对农药的耐受能力[33]。本试验中，乐果作用24 h，昆明裂腹鱼幼鱼HSP70 mRNA的表达量显著升高，与上述研究一致。随着时间的延长，为保持生命体的内环境稳定性，自身的解毒作用使HSP70 mRNA表达量逐渐下降，但在添加维生素C后，该基因表达量下降更为显著，增强了昆明裂腹鱼幼鱼对乐果的耐受性，协助机体完成自身调节功能。

3.6 乐果96 h半致死质量浓度和安全质量浓度对昆明裂腹鱼幼鱼的毒性差异

96 h半致死质量浓度指96 h造成鱼类死亡的外源物质半数致死质量浓度。安全质量浓度表示对鱼类影响极小或基本无影响的外源物质含量。本试验结果表明，乐果质量浓度大于10.182 mg/L(安全质量浓度)的24.890 mg/L试验组和39.598 mg/L(96 h半致死质量浓度)试验组对鱼类的毒性作用极大，39.598 mg/L试验组甚至对机体组织造成难以修复的损伤。而10.182 mg/L试验组和5.091 mg/L试验组对机体的毒性作用较小，刚开始作用时产生应激反应，随着作用时间的延长，能通过自身调节逐渐恢复稳定状态。

4 结 论

本试验通过模拟养殖水体毒性环境，探究有机磷农药乐果对昆明裂腹鱼幼鱼造成的机体损伤，以及维生素C对该损伤的解胁迫能力。试验结果表明，乐果对昆明裂腹鱼幼鱼造成的损伤在一定程度上无法恢复，而维生素C能增强机体的抗胁迫能力，提高机体耐药性，可直接参与机体内过量自由基的清除，在缓解有机磷农药对鱼类神经及氧化损伤方面发挥了积极作用。试验结果有助于及时正确判断养殖水体中昆明裂腹鱼幼鱼对乐果等外源物质的反应和适应程度，并制定有效防治措施，减少不必要的损失，对幼鱼培育过程中减少机体损伤，提高养殖存活率有重要意义。