新疆天山雪岭云杉根际土壤中链霉菌的分离培养及其抑菌活性的初步探究

2020-11-20赵磊木沙江托乎提牛丽娟苟渔林富顺郭飞

石河子大学学报（自然科学版） 2020年5期

赵磊，木沙江·托乎提，牛丽娟，苟渔，林富顺，郭飞*

(1 石河子大学医学院，新疆石河子 832002；2 新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830001)

数十年来，抗生素的出现以及不断推陈出新，极大地降低了临床感染率和死亡率[1]，抗生素的研发在科学研究中一直占据重要地位。天然抗生素主要分离自微生物的次级代谢产物中[2]。而放线菌恰恰是这些次级代谢产物最主要的生产者[3]。放线菌大体可以分为两大类，占据大多数的链霉菌属以及除此之外的稀有放线菌[4]。其中链霉菌是主要的抗生素生产者，据已有的报道表明，目前已经被发现的抗生素种类已经超过了20000种，但是其中真正服务于人类的抗生素不过百余种，而这其中的大多数都来源于放线菌中的链霉菌属[5]。

从Waksman发现链霉菌中的链霉素[6]到后来万古霉素的问世[7]，人们对新抗生素研发的脚步从未停止过。但相较于细菌耐药性的发展，新型抗生素的发展显得十分缓慢[8]。因此对新型抗生素的开发依然是非常急迫的。新疆位于亚欧大陆腹地，为我国最大的省份。自然环境多样且特殊，近些年来，对于新疆地区放线菌资源的报道也层出不穷。研究者们已从罗布泊[9]，天池[10]等环境中获取了大量的放线菌资源。但对于天山地区具有抑菌活性的放线菌链霉菌属的研究还未见报道。天山山脉在我国境内绵延1 700多公里，且雪岭云杉为其单优树种，并为天山山脉所特有[11]。

历经风雨之后，方知社会是复杂的，水仙芝不想把它看得更复杂。她想过一种简单的生活，一种纯净、没有污染的生活。读了很多书，她更不相信书，倒相信感觉。

为了发现更多对临床病原菌有抑制作用的放线菌资源，以及丰富我们对新疆放线菌资源的认识，本课题组从天山山脉的不同区域的雪岭云杉根际部位，采集了5份土壤样品。从中筛选放线菌中的链霉菌属进行鉴定以及抑菌活性初步分析，为获取更多有价值的微生物资源以及开发新疆特色抗生素奠定基础。

在抓实生态文明体制改革的同时，云南省环境污染第三方治理、环境监管执法工作、水污染防治和水功能区管理等改革取得突破。狠抓中央环境保护督察反馈问题的整改落实，建立省级环保督察机制，全省实现对16个州市环境保护督察全覆盖。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集与处理

2019年5月采集自乌鲁木齐南山雪岭云杉森林。选取了5个采样地点，采集贴敷于雪岭云杉根须的土壤，用无菌袋封装土壤样品。在运回实验室之前，保存在4 ℃的车载冰箱内。

牛津杯法菌株的抑菌活性筛选：

表1 雪岭云杉根际土壤采样地点信息

1.1.2 培养基制备

声检查时，患者的体位不一致，可能会对检查造成一定的影响。因此，在以后的研究中可以增大研究的样本量，选择有经验的超声科医生，让患者保持最佳的检查体位，提高研究结果的说服力。

50 mg·L-1重铬酸钾溶液(每种分离培养基在高压灭菌后，温度降至60 ℃左右时，加入3%的重铬酸钾溶液)。

1.1.3 抑制剂

发酵培养基：可溶性淀粉15 g，酵母浸粉5 g，牛肉膏蛋白胨2 g，蒸馏水1 000 mL，pH调整至7.2。

基于配变负载历史数据，对采样数据进行分类预测模型的选择，通过比较分类模型的优劣选出最优模型。分类器模型的选择过程以及分类器的准确率如下图所示。

待检菌株培养基：营养琼脂培养基。

种子培养基：液体高氏一号培养基，液体ISP2培养基。

分离培养基：(1) SEA培养基(土壤浸出液培养基)：土壤浸出液的制备：称取500 g土壤样品，加入1000 mL去离子水，2 g NaOH浸泡过夜。10 000 r·min-1，60 min离心，收集上清液调整PH至7.5，即为土壤浸出液。然后加入2%的吉兰糖胶。121 ℃，15 min高压灭菌。(2)SEG培养基：土壤浸出液1 000 mL，1/10浓度的高氏一号培养基，2%琼脂。(3)SEISP2培养基：土壤浸出液1000 mL，1/10浓度ISP2培养基，2%琼脂。(4)高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，0.5 g MgSO4·7 H2O，0.5 g NaCl，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 20 g，1 L去离子水，pH调节至7.5。(5)ISP2培养基：麦芽浸粉10 g，酵母浸粉4 g，D-葡萄糖4 g，琼脂20 g，1 L去离子水，pH调节至7.2。

1.1.4 抑菌活性实验检测菌株

1.2.5 与抗生素合成有关的基因簇检测

在重选样中我们选择重砂1、重砂3、重砂5及重选尾矿进行了全方位考察。铌钽矿物、黄铁矿等金属硫化物及其他比重较大的矿物主要富集于重砂1中，为此又对重砂1进行了浮选分离(表6)，分离出以硫化物为主的硫精矿(浮硫精)和以氧化物为主的硫尾矿(浮硫尾)。重砂5中除石英外，云母含量亦较高，云母为铷的重要载体矿物，故我们对重砂5中云母进行了浮选富集。重选尾矿样经X衍射分析结果表明，成分主要为云母、石英和长石类矿物。

1.1.5 主要试剂及仪器

很多企业的内控制度并不健全，领导及员工的内部控制意识淡薄。这主要表现为：①有的企业没有设置内部控制制度。②有的企业虽然制定了内部控制制度，但该制度存在缺陷，缺乏可操作性。③有的企业设定了有效的内控制度，但是员工并没有按制度执行。

综上所述，在当前我国高校建设和发展中，为了拓展高校教育建设资源，对于图书馆职能的建设和优化也越来越重视，通过对图书馆建设中的管理系统开发设计，能够更好地管理图书资源，实现对图书资源管理的科学化部署能力提升。通过本文的研究和分析，将高职院校图书馆管理系统开发与设计主要从以下几点进行了研究：一是数据库的开发与设计；二是功能模块设计和优化；三是管理系统的优化设计，借助这种系统优化设计分析，能够将整体的高职院校图书馆管理系统设计好，便于高职院校图书馆建设的科学化发展。

溶菌酶，蛋白酶K，RNA酶，醋酸钠等DNA提取用品购于索莱宝公司；DNA Marker，Premix Taq购于Takara；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂；恒温震荡摇床HZQ-2，金坛市医疗器械厂；洁净工作台SW-CF-2FD，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；离心机centrifuge 5430R，德国Eppendorf公司；旋涡混匀器XH-C，金坛市医疗仪器厂；PCR扩增仪PowerCycler SL 96 Gradient，德国Biometra公司；电泳仪DYY-6C型，北京市六一仪器厂；凝胶成像仪Gel Doc-It2 310 Imager，美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

将采集的样品放入200目细目筛中过筛处理，自然风干28 d。取1 g风干的土壤样品，加入9 mL去离子水。在旋涡混匀器上剧烈震荡10 min，静止5 min。取上清液1 mL置于无菌管中，将土壤悬液终浓度调整至10-4g·mL-1，备用。

1.2.2 根际土壤菌株的筛选分离

将1.2.1中制备好的土壤悬液，取200 μL均匀涂布于5种分离培养基上。放置培养箱中30 ℃培养28 d。按照伯杰氏细菌手册所描述的链霉菌属特征，将疑似菌株(干燥、产生色素、孢子成堆等特点)小心挑取进行纯化培养。

(1)发酵液的制备：挑取已经纯化好的菌株或刮取少量的菌苔于10 mL的种子培养基中，放入恒温震荡培养箱中30 ℃，160 r·min-1培养72 h。用移液器吸取种子培养基中的菌液加入发酵培养基中，使菌液的浓度占据发酵培养基的5%。以同样的条件放入摇床培养2周。将摇好的菌液12 000 r·min-1，10 min离心收上清，并用0.22 μm的滤膜将上清液过滤备用。

具体DNA提取方法步骤参考姜淑梅等人的方法进行改良[12]。PCR扩增引物为27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。扩增体系为25 μL：12.5 μL的2×Premix Taq，10 pmol 27 F，10 pmol 1492R，50 ng的DNA模板，加灭菌水至25 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min。95 ℃变性30 s，55 ℃退火2 min以及72 ℃延伸2 min进行35个循环。最后72 ℃延伸10 min。所得PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测并送去生工(上海)生物工程股份有限公司进行测序。运用NCBI的BLAST程序对测序所得序列进行比对，选取有效发表的同源性较高的序列，用DNAMAN进行多序列比对，采用MEGA7.0软件中的邻接(neighbor-joiningmethod,NJ)构建系统发育树[13]。

1.2.4 筛选所得菌株的抑菌活性检测

此外，“冒进”风险也不容小觑。各地兴起的“粮食银行”以企业自发行为居多，在发展定位、管理水平、操作流程等方面参差不齐，有的在小规模储售粮时运作自如，往往产生盲目乐观的心态，提出“大干快上”的目标，形成经营风险。

1.2.3 菌株DNA的提取及16SrRNA生物分子学分析

(2)将待检测病原菌株用灭菌水将其浓度稀释至0.5麦氏比浊管，并吸取200 μL涂布于NA培养基上。而后将灭菌牛津杯(内径6 mm，外径8 mm，高10 mm的圆柱不锈钢小管)放置其上。每个牛津杯中加入(1)中制备好的过滤上清液200 μL。30 ℃，培养48 h后观察抑菌情况并记录抑菌圈大小。

大肠杆菌(Escherichia coil)标准株ATCC25922，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)标准株ATCC25923，以上两种菌株由中国科学院(新疆)微生物研究所保藏。临床分离株耐甲氧西林金葡菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、产超广谱β内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)大肠杆菌、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)由石河子大学医学院提供。

《经济学人》中国专栏的报道并非只有讽刺或消极类，也有一些报道对中国的经济状况或现象持肯定态度。2016年6月11日的中国专栏中，其中有一篇报道了关于温州经济的现状。该报道中包含三则概念隐喻——“对抗金融危机是战争”、“银行是人”和“经济发展是旅程”。在“对抗金融危机是战争”概念隐喻中，金融危机对应于敌人，对抗金融危机对应于战争（例14）。在“银行是人”概念隐喻中，银行逐渐从金融危机的阴影中走出来对应于人逐渐恢复健康（例15）。在“经济发展是旅程”概念隐喻中，用于承担风险对应于勇敢面对旅途中的危险（例16）。

PSKⅠ扩增基因为K1F(5′-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3′)和M6R(5′-CGCAGG-TTSCS-GTACCAGTA-3′)，PSKⅡ扩增基因为KSα(5′-TSGCSTGCTTCGAYGCSATC-3′)KSβ(5′-TGGAANCCGCCGAABCCGCT- 3′)。非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)扩增基因为A3F(5′-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3′)，A7R (5′-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3′)[14-15]。三对引物均上海生工合成。

3对引物反应体系均与1.2.3中的相同，PSKⅠ反应条件为95 ℃，5 min预变性。95 ℃，30 s，55 ℃，2 min，72 ℃，90 s。30个循环。72 ℃，10 min。PSKⅡ反应条件为95 ℃，5 min预变性。95 ℃，30 s，60 ℃，2 min，72 ℃，60 s。30个循环。72 ℃，10 min。NRPS反应条件为95 ℃，5 min预变性。95 ℃，30 s，59 ℃，30 s，72 ℃，60 s。30个循环。72 ℃，10 min。

2 结果与分析

2.1 雪岭云杉根际土壤可培养链霉菌分离结果分析

从5份样品，5种培养基中共分离得到160株菌株，而后根据形态学去除冗余，并通过PCR技术扩增16SrRNA基因对菌株进行鉴定。经过序列比对分析得出：我们共分离出77株放线菌，其中链霉菌属41株，占据53.38%。所分离的菌株TS007与有效序列Streptomyces griseoincarnatus(MK928393)，Streptomyces variabilis(KF551876)，Streptomyces sp.(JX244132)的相似性分别为97.97%、97.43%以及97.96%。菌株TS054与已知菌株Streptomyces venezuelae strain(MF077023)，Streptomyces exfoliatus(KF730770.1)的相似性分别为98.11%和98.10%、TS066与有效菌株Streptomyces ambofaciens(KR47-6414)，Streptomyces sp.(KX279622)的同源性在96.92%，96.99%。利用MEGA7.0软件中的邻接法(Neighbour-Joining,NJ)构建系统进化树如图1所示。三株菌株均与链霉菌属的有效菌株聚在一起，且形成独立的分支，可能为潜在新种。在菌株分离结果中，我们观察到培养基的浓度影响着菌株分离的多样性以及新链霉菌的分离，潜在新种TS007分离自SEA培养基，TS054和TS066分离自改良低浓度ISP2培养基。在一般商品化培养基，高氏一号培养基，改良高氏一号培养基以及ISP2培养基未分离出潜在新种。

图1 基于16S rRNA基因序列构建的菌株TS007、TS054、TS066与其相近种的N-J系统进化树

2.2 抑菌活性分析

牛津杯法抑菌试验结果表明，至少对一种病原菌有抑菌作用的菌株一共22株，占比53.66%。具体抑菌情况如表2所示。结果显示TS014抑菌活性最为突出，对于所选菌株均有抑制作用。其中对金黄色葡萄球菌抑制作用非常明显，抑菌圈达到35 mm。

赛事组织者作为体育赛事的组织、承办者，在整合体育赛事资源方面具有得天独厚的优势，理论上能够最大化地实现体育赛事转播权的价值转化。但是在权源上，它不像参赛者那样贴近体育赛事，而更像是一个代理商：除了通过合同约定之外，很难证明其对体育赛事享有权利的正当性。参赛者则不同，作为体育赛事的直接参与者，其对体育赛事的权利诉求更为合理。但是体育赛事往往是多名参赛者共同完成的，尤其是足球联赛这类大型竞技类运动，往往涉及到十几支参赛球队。如果由参赛者自行处理其体育赛事转播权，不仅容易出现争执，而且在效率上也是不经济的。

表2 分离自雪岭云杉根际土壤链霉菌的抑菌活性

2.3 功能基因的筛选结果

本实验选取了3对功能基因的引物对41株菌株进行检测。结果显示：大部分菌株都至少具有一条功能基因。一共32株，占比78.04%。其中PSKⅠ基因阳性13株，占比31.70%；PSKⅡ基因阳性菌株22株，占比53.66%；NRPS基因阳性菌株25株，占比60.98%。其中TS008、TS046、TS056在3种基因的检测中均表现为阳性，且在抑菌活性实验中均表现出了良好的抑菌效果。具体占比情况如表3所示。

表3 雪岭云杉根际土壤分离获得的代表性链霉菌菌株功能基因筛选

3 讨论

链霉菌属一直是抗生素研发的主力，目前运用于临床的抗生素有超过70%都来源于链霉菌菌株的次级代谢产物[5]。近些年来已经有很多研究机构对新疆放线菌资源进行研究，但就新疆具有抑菌活性链霉菌属的报道还较为少见。本实验中，我们从5份土壤样品中共分离到41株链霉菌，且菌株TS007、TS054、TS066经过系统发育分析，可能为潜在新种。值得注意的是，TS007分离自SEA寡营养培养基，TS054和TS066分离自低浓度改良ISP2培养基。且经过验证，这三株菌株可在添加了土壤浸出液的高氏一号培养基、ISP2培养基中生长良好。但是在普通蒸馏水配置的培养基中生长缓慢或不产生气生菌丝。这些现象表明，土壤浸出液中的某些营养成分是培养基的营养成分更接近于这3株菌株的自然生长环境，更适宜它们的生长。同时，我们也推测寡营养和低营养培养基更适合此地新型放线菌的分离。

目前在世界范围内，滥用抗生素的现象依然普遍。使得耐药菌株的种类越来越多，甚至出现了对大多数抗生素都产生耐药作用的“超级细菌”[16]。目前临床上耐药性情况最为严峻的为肠杆菌属，金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，铜绿假单胞菌，鲍氏不动杆菌。这6类病原菌被合并简称为ESKAPE[17]。其中耐甲氧西林金葡菌(MRSA)与HBV、AIDS已并列成为临床三大感染性疾患[18]。根据这一严峻情况，本实验选用了其中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，产β内酰胺酶肠杆菌为靶标进行了抑菌活性初步研究，另外选取了敏感型大肠杆菌，金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌。其中对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有抑制作用的有7株，对产β内酰胺酶肠杆菌具有抑制作用的有4株。对二者均具有抑制作用的有2株。值得一提的是，三株潜在新种链霉菌有两株都能抑制耐甲氧西林金葡菌的生长，且三株菌株都具备抗生素合成相关基因PSKⅠ、PSKⅡ、NRPS[19]。但TS054在本次抑菌实验中未显现出抑菌性，可能与发酵条件有关。

与此同时，抗生素合成相关基因检测结果中至少具有其中一种基因的菌株共32株，总占比78.04%。其中PSKⅠ基因阳性13株，占比31.70%；PSKⅡ基因阳性菌株22株，占比53.66%；NRPS基因阳性菌株25株，占比60.98%。此比例要明显高于抑菌实验结果，在一定程度上可以指导我们预测具有抗生素研发潜力的菌株，也提醒研究人员可以尝试对某些菌株的发酵条件进行进一步的优化。但同时，比较两组实验的结果，我们发现，菌株TS014经过3种基因检测，结果均为阴性。我们分析推测，可能菌株TS014具有除实验中所选3种基因之外的其他抗生素合成相关基因，例如PKSⅢ[20]。也可能是某种未知的功能基因，值得我们进一步设计实验进行研究。