UPLC法同时测定蔷薇红景天中络塞维、络塞琳和络塞定的含量

刘丹妮，张珂，陈晓祥，杨璐，潘馨慧，王航宇，王金辉,3*

(1 石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子，832002；2 新疆林业科学院/新疆林业资源与利用国家林草局重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052；3 深圳弘汇生物医药有限公司，广东 深圳 518000)

蔷薇红景天(RhodiolaroseaL.)是一种在欧洲和亚洲广泛应用的药用植物，其在中国主要分布在东北、西北和西南，广泛生长于新疆地区，其具有抗脑缺血、抗氧化、抗辐射、调节免疫和抗疲劳等功效[1-4]。蔷薇红景天中主要含以下几类化学成分：苯丙烯醇苷类(络塞维，络塞琳)，苯乙醇苷类(红景天苷，酪醇)，黄酮苷类(草质素甙，山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖甙)单萜类(络塞定)，其中红景天苷、酪醇以及络塞维是蔷薇红景天中主要的活性成分，主要特征性成分是络塞维、络塞琳和络塞定等化合物[5](图1)。研究发现，蔷薇红景天具有双向调节和延缓衰老的药理活性，这种的活性不仅与红景天苷相关更与其特殊成分络塞维，络塞琳等苯丙素苷类成分有关。络塞维是某些品种红景天中重要活性成分，它在蔷薇红景天中含量较高，是其特有指标成分之一，具有良好的抗炎，和抗肺纤维化的作用[6-7]。络塞琳和络塞定可以有效的促进神经兴奋抗抑郁症[8-9]、益智[10-11]、抗癌[12]等作用。

图1 络塞维、络塞琳和络塞定的化学结构

目前，在《中国药典》收录的红景天药材为大花红景天(RhodiolacrenulataHk.F.et al.,Thoms)[13]，主要对红景天苷进行质量监控，而对络塞维、络塞琳和络塞定的质量控制较为缺少。有部分研究集中于对蔷薇红景天有效成分的分离纯化，其活性成分和质量控制的也主要集中在红景天苷，而对其特有成分络塞维，络塞琳和络塞定的研究较少，其含量测定也多采用HPLC，检测时间较长，分离度低[14-15]。

本研究中建立了UPLC方法同时测定蔷薇红景天中络塞维、络塞琳和络塞定的含量，多种成分的含量测定可以全面反应药材质量，提高其抗炎、抗肺纤维化和抗抑郁等药理作用。该方法取样量少，简单快速，灵敏度和分离度高，为有效的控制蔷薇红景天的质量和改善药理作用提供更高效的方法，为其制剂的研发和临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪(Waters ACQUITY UPLC，美国Water公司)，Empower 2.0色谱工作站，FW-100型高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器有限公司)，BSA224S型万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，SY-360型超声波清洗仪(上海宁商超声仪器有限公司)，TGL-16G型离心机(上海安亭科学仪器厂)，SZ-93 A自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

蔷薇红景天，由石河子大学药学院谭勇教授鉴定为红景天属蔷薇红景天干燥的根，络塞维(实验室自制，纯度≥98%)，络塞琳(实验室自制，纯度≥98%)，络塞定(实验室自制，纯度≥98%)，甲醇、乙腈(色谱级，DUKSAN化学试剂公司，韩国)，分析级磷酸(武汉化学试剂厂)，水(实验室自制)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)柱，流动相A：甲醇-乙腈(1∶1)，流动相B：0.1%的磷酸水溶液，梯度洗脱条件见表1，流速为0.2 mL · min-1，柱温：30 ℃，检测波长为210 nm。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品络塞维、络塞琳和络塞定各适量，分别置于10 mL容量瓶中，使用色谱级甲醇进行溶解，并定容至刻度线，摇匀，即得到浓度分别为1.000、0.940和5.500 mg · mL-1的络塞维、络塞琳和络塞定对照品储备溶液。

精密吸取1.000、0.940和5.500 mg · mL-1的络塞维、络塞琳和络塞定对照品储备溶液适量，分别置于2 mL容量瓶中，使用色谱级甲醇进行定容，摇匀，即可得到每1 mL含络塞维 150.00 μg、络塞琳 47.00 μg和络塞定 550.00 μg的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

精密称取蔷薇红景天粉末约1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，混匀后，进行重量的称定，在室温条件下超声30 min，溶液恢复到室温，再次重量称定，使用甲醇补足重量，混匀后，于4 000 r · min-1条件下离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，滤液即为蔷薇红景天供试品溶液，取1 μL供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 专属性考察

精密吸取甲醇溶剂、混合溶液和蔷薇红景天供试品溶液在“1.2.1”色谱条件下进样分析，进样量1 μL。

1.2.4.2 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 μL，在“1.2.1”色谱条件下进行色谱分析，以对照品的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，计算回归方程。

1.2.4.3 精密度试验

取同一混合对照品溶液重复进样6次，进样量1 μL，以“1.2.1”色谱条件进行色谱分析。计算络塞维、络塞琳和络塞定峰面积的RSD值。

1.2.4.4 稳定性试验

室温条件下，同一份供试品溶液分别取1 μL于0、1、2、4、6、8、12 h在“1.2.1”色谱条件下进行色谱分析，计算络塞维、络塞琳和络塞定在12 h的峰面积的RSD值。

1.2.4.5 重复性试验

精密称取同一批号蔷薇红景天供试品6份，按照“1.2.3”方法制备供试品溶液，取1 μL供试品溶液在“1.2.1”色谱条件下进样分析，检测络塞维、络塞琳和络塞定的含量并计算RSD值。

1.2.4.6 加样回收率试验

精密称取已测含量的同一批次蔷薇红景天供试品6份，每份质量约1 g，分别精密加入等量的混合对照品溶液，按照“1.2.3”的方法制备供试品溶液，在“1.2.1”色谱条件下进样1 μL进行分析，检测供试品的含量，并计算络塞维、络塞琳和络塞定平均回收率和RSD值。

1.2.4.7 样品测定

精密称取8批新疆省不同批次的蔷薇红景天，按照“1.2.3”的方法制备供试品溶液，在“1.2.1”色谱条件下进样1 μL进行分析，分别测定样品中络塞维、络塞琳和络塞定的含量。

2 结果

2.1 专属性试验

供试品和对照品具有相同保留时间的色谱峰，空白溶剂甲醇在保留时间处未出现色谱峰，说明溶剂无干扰。色谱图见图2。

a：空白溶剂;b：络塞琳对照品;c：络塞维对照品;d：络塞定对照品;e：对照品混合溶液;f：蔷薇红景天供试品；1：络塞琳;2：络塞维;3：络塞定。

2.2 标准曲线的建立

以对照品的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，建立各成分标准曲线，结果显示络塞维、络塞琳和络塞定在一定浓度范围内呈现良好的线性关系，回归方程及线性范围如表2所示。

表2 络塞维、络塞琳和络塞定的线性回归方程 n=7

2.3 精密度试验

数据分析得到络塞维、络塞琳和络塞定峰面积的RSD值分别为0.26%、0.30%和0.24%，结果显示仪器具有良好的精密度，为检测结果的准确性提供基础。

2.4 稳定性试验

检测得到络塞维、络塞琳和络塞定的峰面积，数据分析显示RSD值分别为1.30%、0.82%和0.39%，说明蔷薇红景天供试品在室温条件下12 h具有良好的稳定性。

2.5 重复性试验

检测得到络塞维、络塞琳和络塞定的峰面积，数据分析显示RSD值分别为1.49%、1.41%和1.26%，说明该方法具有良好的重复性。

2.6 加样回收率试验

平行测定6份供试品，检测得到络塞维、络塞琳和络塞定平均回收率结果见表3，数据分析显示RSD值分别为2.61%、2.86%和2.54%，加样回收率符合标准范围。

表3 络塞维、络塞琳和络塞定的回收率测定结果 n=6

2.7 样品测定

按照“1.2.4.7”的方法操作，将8个不同批次(S1-S8)的蔷薇红景天样品测定结果通过2.2建立的线性回归方程计算各样品中络塞维，络塞琳和络塞定的含量(表4)。

表4 样品含量测定结果 n=3

3 讨论

3.1 检测波长的选择

本实验中采用紫外-可见分光光度法，在190～400 nm波长范围内进行全波长扫描，发现络塞维、络塞琳和络塞定在210 nm处均有良好的峰形。210 nm作为检测波长，能够适用于各组分的检测，同时响应值均匀有效，结果具有代表性。

3.2 流动相的选择

为实现供试品中络塞维、络塞琳和络塞定有效的分离，并且不受溶剂和其他化学成分影响，对方法中流动相进行优化，选用甲醇-水、甲醇-0.1%的磷酸溶液、乙腈-0.1%的磷酸溶液和甲醇-乙腈-0.1%的磷酸溶液分别作为流动相进行梯度洗脱。结果显示，甲醇-乙腈-0.1%的磷酸溶液流动相系统具有良好的分离效果，故优选该流动相系统对样品进行梯度洗脱。

3.3 提取方法的选择

本实验考察了提取溶剂体积和提取时间对样品提取率的影响，选用25、50 mL的甲醇溶剂对同一批蔷薇红景天药材粉末进行超声处理30 min，溶剂体积为25 mL时，可将样品中络塞维、络塞琳和络塞定3种成分完全提取，故选用25 mL甲醇溶剂进行样品提取。对提取时间的考察，采用25 mL甲醇为提取溶剂，分别超声提取20、 30、60 min，结果显示，提取时间为30 min时上述3种成分可以完全被提取。因此，优选25 mL甲醇，超声提取30 min为提取条件。

3.4 含量测定

研究中考察了不同批次样品中络塞维、络塞琳和络塞定的含量，收集了新疆省8个不同批次的蔷薇红景天药材，研究结果显示，不同批次蔷薇红景天中络塞维、络塞琳和络塞定的含量存在较大差异，含量范围为0.01%～1.85%、0.04%～0.51%和0.11%～3.26%，这可能与药材的生长年限、采集时间、气候等有较大的相关性。络塞维、络塞琳和络塞定是蔷薇红景天中特殊的有效活性成分，络塞维不仅具有抗氧化、抗疲劳等基本功效还有良好的抗炎和治疗肺纤维化的作用，络塞琳和络塞定也可以促进神经兴奋，具有抗抑郁和抗癌等功效。通过对其含量测定可明确药物有效成分的含量，对蔷薇红景天以及相关制剂的安全性和有效性进行评价和控制，为改善药物的药理作用，提高药用价值提供基础。

综上，本研究所建立的蔷薇红景天中络塞维、络塞琳和络塞定的含量测定方法，具有灵敏度和精确度高，简单快捷，准确性和重现性良好，稳定性高，可应用于蔷薇红景天的含量测定，优化其质量控制。该研究为蔷薇红景天的药动学以及系统药理学等研究奠定一定的基础，同时为其制剂研发和临床应用提供依据。