鸡传染性法氏囊病与大肠杆菌混合感染的诊断与防治

丁树荣，李婷婷*，陆冰洋，刘华栋，唐娟，王彩先

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所太原 030032）

2020 年4 月太谷县某鸡场发生疫病，30 日龄雏鸡陆续发病，出现精神沉郁、采食量下降、并有零星死亡，场主带3 只刚死亡雏鸡和3 只发病活雏鸡前来本实验室进行诊断。经病理剖检和实验室诊断，确诊为传染性法氏囊病继发感染大肠杆菌。经对症治疗后，病情很快得到控制。

1 临床症状

病鸡精神沉郁，有的闭眼缩脖、羽毛蓬乱，有的卧地不起、反应迟钝；体温升高，采食量和饮水量均下降，排白色水样稀便、肛门周围羽毛被粪便污染，病程6d 左右，每天零星死亡3～5 只。

2 病理变化

对病鸡和病死鸡进行病理剖检可见，心脏和肝脏被白色纤维素性沉淀物包裹，呈现“包心包肝”现象；气囊浑浊；肝脏肿大，呈土黄色，质脆易碎；腺胃与肌胃交界处出血；十二指肠、小肠黏膜水肿、出血；盲肠扁桃体肿大、出血；法氏囊水肿，体积增大约2～3倍，有出血点和出血斑，法氏囊切开，可见白色渗出物。其他脏器未见明显病变。

3 实验室检测

3.1 细菌的分离培养

无菌采集病鸡心血及肝脏组织，划线接种于营养琼脂平板。经37℃恒温培养24h，可见琼脂上形成一种圆形凸起、表面光滑湿润、边缘整齐的灰白色菌落。挑取单个菌落，划线接种于麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂，穿刺接种于三糖铁斜面，37℃培养24h。结果如图1、2、3。

培养结果可见，在麦康凯琼脂上形成红色圆形菌落，伊红美蓝琼脂上形成黑色带金属光泽的菌落，三糖铁斜面产气变色。

挑取麦康凯琼脂上单个菌落涂片，经革兰氏染色后镜检，结果如图4，可见两端钝圆、呈红色的革兰氏阴性短杆菌。

图1 麦康凯琼脂

图2 伊红美蓝琼脂

图3 三糖铁斜面

图4 革兰氏染色结果

3.2 生化鉴定

将纯化培养的细菌接种于营养肉汤，37℃培养24h 后，进行常规生化试验鉴定，结果可见表1，根据生化试验结果，判定分离菌为大肠杆菌。

表1 生化鉴定结果

3.2 细菌药敏试验

采用K-B 试纸扩散法[1]，以标准质控菌株ATCC25922 为参照，选用22 种临床常用药物进行敏感性试验。使用灭菌棉拭子蘸取纯培养的大肠杆菌菌液，均匀涂布在营养琼脂平板上，将镊子于酒精灯灼烧后，取药敏纸片等距离贴于营养琼脂表面。37℃培养24h 后观察结果。结果参考CLSI 标准做出判定[2]，结果见表2。

由表2 结果可知，大肠杆菌分离株对氧氟沙星、丁胺卡那、环丙沙星高度敏感，对磷霉素、培氟沙星、头孢噻肟、恩诺沙星、庆大霉素中度敏感，其他药物均耐药。

表2 药敏试验结果

3.3 IBDV RT-PCR 鉴定

根据GeneBank 中发表的IBDV 基因序列设计引物：IBDVF：5'-CGTTTCCCTCWCAATCCACG-3'，IBDVR：5'-CTCATGTCTTCATGAGACAG-3'，扩增其保守序列，目的片段为831bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。

3.3.1 病毒RNA 的提取采集送检发病鸡的肝脏、脾脏、肺脏和法氏囊器官各1g，剪碎混匀后称取0.05g 混合物，加入1mL 生理盐水进行研磨匀浆。8000rpm 离心2min 后，取上清液100μL 于新的离心管中，按照RNA 提取试剂盒使用说明书，经过裂解、吸附、洗涤、洗脱后得到模板RNA 备用。

3.3.2 RT-PCR 扩增及电泳 参照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒说明书对病毒RNA 进行反转录。PCR 反应按照10×Dream Taq Buffer 5μL；IBDVF（10 μmol/L）2μL；IBDVR（10μmol/L）2μL；dNTP（10μmol/L）1μL；ddH2O 28.5μL；Template 8μL；Taq 酶（5U/μL）0.5μL；MgCl23μL；混合均匀成50μL 反应体系。PCR扩增程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸60s，循环共35 次；最后72℃延伸10min。PCR 扩增产物在110V 电压下使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5。

由图5 可见，被检测样品扩增出831bp 的特异性条带，初步判定从病料中分离的病毒为IBDV。

图5 新城疫RT-PCR 检测结果

4 结果与诊断

根据病鸡临床症状、病理剖检变化及实验室检测结果，病鸡可诊断为传染性法氏囊病继发大肠杆菌感染。

5 治疗

淘汰并无害化处理发病鸡。鸡群紧急注射接种传染性法氏囊高免卵黄抗体1mL/羽。根据药敏试验结果选用高敏药物丁胺卡那饮水治疗大肠杆菌感染，连用5～7d。加强养殖场饲养管理，做好日常消毒和清洁工作。第3d 开始无新增发病和死亡病鸡，经过5d 治疗，鸡群基本痊愈。

6 讨论

传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由传染性法氏囊病病毒（lnfectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病[3]，该病主要侵害3～7 周龄雏鸡，以损伤鸡的免疫器官法氏囊中的淋巴细胞为特征，导致免疫抑制，降低病鸡对疫苗的免疫效力，增加了病鸡对其它细菌性和病毒性疾病的易感性，临床上常伴发细菌性疾病的混合感染[4]，且近年来山西分离到IBDV 超强毒株[5]，使鸡的死亡、淘汰率增加，生产性能下降，给养鸡业造成巨大危害和损失。目前针对IBD 的治疗尚无特效药物，疫苗接种仍是主要防治手段。随着养殖业和免疫技术的发展，大型现代化养殖场鸡传染性法氏囊病免疫良好，但仍有部分地区的散养户未严格执行免疫程序和鸡舍消毒措施，导致免疫失败甚至IBD 的流行和传染。本研究中该鸡场在已免疫IBD 疫苗后仍发病，可能与雏鸡母源抗体参差不齐、疫苗运输及使用不当等因素有关[5,6]。

大肠杆菌是生产养殖中常见的一种条件性致病菌，鸡群在受到IBD 等免疫抑制疾病感染时，免疫力下降，加之较差的鸡舍饲养环境都增加了大肠杆菌等致病菌的感染率。临床上分离到的大肠杆菌耐药性强，严重影响了药物的选用和治疗，因此在鸡群发病初期就应及时通过实验室诊断及药敏试验选择合理高敏的抗生素药物进行治疗。

养殖场和养殖户要选择正确的疫苗，严格执行合理的免疫程序和免疫监测制度，鸡群发生本病后，病鸡应及时注射鸡传染性法氏囊病高免血清或高免卵黄抗体进行治疗；定期消毒，每周轮流使用两种消毒剂，对养殖环境和养殖工具进行全面彻底的喷洒消毒2～3 次，防止疫情扩散和蔓延；保持鸡舍通风，由于山西地区春季昼夜温差较大，要协调好通风和保温工作。█