过硫酸氢钾复合物粉的制备及其相关性能研究

周德刚，李朋朋*，师梦超，杨会鲜，杨绒娟

（洛阳惠中兽药有限公司，国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳 471003）

自2018 年8 月以来非洲猪瘟在我国大部分省份暴发流行，2020 年2 月在湖南又发生了高致病性禽流感疫情，因此畜禽养殖业中的生物安全防控工作日益严峻，人们对消毒剂的使用越来越重视，其中以过硫酸氢钾复合盐为主成分的消毒剂因其具有广谱高效、低毒环保等特点而受到广泛关注。过硫酸氢钾复合盐消毒剂具有较强的氧化能力，在水中经过链式反应连续产生活性氧，干扰病原体的DNA 和RNA 合成，从而杀灭病原体[1]，1989 年它被美国EPA 批准用于预防杀灭多种细菌和病毒的高效消毒剂，2005 年被美国农业部用于机场出入境消毒，目前已在美国、英国等几十个国家上市，被广泛应用于各型农场、环境、饮水设备和空气消毒。2020年国内暴发新型冠状病毒肺炎疫情，根据国家卫健委办公厅发布的关于部分消毒剂在新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控期间紧急上市的通知，过硫酸氢钾复合物粉被紧急批准用于肺炎疫情防控[2,3]。目前市售的国产过硫酸氢钾复合物消毒剂存在有效成分下降较快、溶水性不合格及杀菌效果与原研产品相差较大等问题，影响了该产品在临床中的推广应用。本文采用过硫酸氢钾复合盐为主成分，并辅以多种具有不同功能的辅料，制备出一种质量与进口产品相当的过硫酸氢钾复合物粉消毒剂，并对其稳定性及消毒效果进行了研究，以期为畜牧养殖业提供一种合格高效的消毒产品。

1 试验材料

1.1 试剂

营养肉汤、营养琼脂，购自青岛高科园海博生物技术有限公司；小牛血清，购自郑州益康生物有限公司；硫代硫酸钠（五水），分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；单过硫酸氢钾复合盐，上海安尔信化学有限公司；十二烷基苯磺酸钠，西陇化工股份有限公司。

1.2 主要仪器设备

ABS-265 双量程电子天平：METTLER TOLEDO；NU-425-400S生物安全柜：美国Nuaire；电热恒温培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；全自动立式电热压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；核酸蛋白测定仪：德国Eppendorf；微量移液器：德国Eppendorf 公司；涡旋混合器：德国IKA 公司；Seven Easy pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 菌株

大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC6538，购自中国兽医药品监察所。

1.4 消毒剂

过硫酸氢钾复合物粉：照2 中方法自制。对照药品：市售进口产品：批号1806BA0147。

2 试验方法

2.1 过硫酸氢钾复合物粉的制备

以过硫酸氢钾复合盐为主成分，氨基磺酸、苹果酸、氯化钠、十二烷基苯磺酸钠、六偏磷酸钠为辅料，参照专利US4822512[4]制得过硫酸氢钾复合物粉消毒剂，所得消毒剂的有效氯含量不得低于10%。

2.2 稳定性考察试验

稳定性试验依据《兽用化学药物稳定性研究技术指导原则》[5]进行设计，并按照农业农村部公告第2357 号[6]进行样品检测。

2.2.1 有效成分检测方法氯化钠：取本品5g，精密称定，置250mL 烧杯中，加水200mL 溶解后，立即照电位滴定法用硝酸银滴定液（0.1mol/L）滴定，记录硝酸银滴定液消耗的体积量。每1mL硝酸银滴定液相当于5.844mg 的氯化钠。

有效氯：取本品约10g，精密称定，置1,000mL 量瓶中，加水适量振摇使溶解并稀释至刻度，精密量取100mL，置250mL 锥形瓶中，加10%醋酸溶液10mL 和碘化钾1g，振摇使溶解。用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定至近终点时，加淀粉指示液2mL，继续滴定至溶液变成原料的粉红色，并将滴定结果用空白试验校正。每1mL 的硫代硫酸钠滴定液相当于3.545mg 的氯。

2.2.2 稳定性试验方法影响因素试验：将过硫酸氢钾复合物粉分别在照度4,500Lx、60℃、（25℃、75%湿度）的条件下放置10d，于0、5、10d 取样检测，考察样品各指标的变化情况。

加速试验：将过硫酸氢钾复合物粉在40℃、相对湿度75%条件下放置6 个月，于第0、1、2、3、6 个月取样检测，考察样品各指标的变化情况。

2.3 消毒效果评价试验

按照《兽用消毒剂鉴定技术规范》[7]第三章、第四章中规定进行，评价了过硫酸氢钾复合物粉对大肠杆菌8099 和金黄色葡萄球菌ATCC6538 的消毒效果，并与市售进口产品进行比较。

2.3.1 菌悬液制备取出菌种进行复苏，在营养琼脂培养基上划线。将接种后的培养基放在恒温培养箱中，37℃培养20h。从生长良好的平板上挑取单克隆，在培养基上划线，将接种后的培养基放在恒温培养箱中，37℃培养20h。从传代后的平皿上挑取4～10 个典型菌落至PBS 中，取部分菌悬液用核酸蛋白测定仪测定OD600值，将剩余菌悬液的OD600值调整至0.14～0.15，按此比例调整剩余菌液，混合均匀后进行2 倍稀释，各菌液浓度约为1.0×107cfu/mL，备用。

2.3.2 中和剂选择试验用0.5%的硫代硫酸钠溶液作为过硫酸氢钾复合物粉的中和剂，用大肠杆菌进行中和选择试验，将试验菌悬液与消毒剂按1∶9 比例作用5min，作用液与中和剂按1∶9 比例中和作用10min。试验分以下6 组：第1 组：消毒剂+菌悬液，证明消毒剂在试验浓度下是否有杀菌或抑菌作用；第2 组：（消毒剂+菌悬液）+中和剂，证明中和剂能否中和残留消毒剂的抑菌作用；第3 组：中和剂+菌悬液，证明中和剂是否抑菌；第4 组：（消毒剂+中和剂）+菌液，证明消毒剂与中和剂的反应产物有无抑菌作用；第5组：稀释液+菌悬液，作为阳性对照；第6 组：稀释液、中和剂、未接种培养基，作为阴性对照。第1 组、第2 组吸取消毒作用后的作用液原液接种琼脂平皿，第3 组、第4 组、第5 组将消毒作用后的作用液用PBS 进行10 倍系列稀释，取10-2、10-3 接种琼脂平皿。

2.3.3 过硫酸氢钾复合物粉对微生物的定量杀灭试验用无菌纯化水溶解并稀释过硫酸氢钾复合物粉，吸取0.5mL 各试验菌液置于4.5mL 各消毒剂中，涡旋混匀后开始计时，作用5min。计时结束后取菌药混合液0.5mL 加入到4.5mL 中和剂中，涡旋混匀20s后开始计时，作用10min，计时结束后进行活菌计数。以PBS 代替消毒剂，其它操作同上述步骤，作为阳性对照组。同时设阴性对照组。当消毒剂最高稀释倍数的杀菌率均在99.9%以上时，可判定该稀释倍数为消毒剂的有效杀菌浓度。按照下述公式计算杀菌率（Pt）。该试验重复进行3 次，以3 次试验杀菌率的平均值表示最终杀菌率。

杀菌率（Pt）=[（N0-Nt）/N0]×100%。其中N0=对照组的活菌数，Nt=试验组的活菌数。

2.3.4 过硫酸氢钾复合物粉对微生物的定性杀灭试验用无菌纯化水溶解并稀释过硫酸氢钾复合物粉，取稀释好的各菌液2.5mL加入到2.5mL 各浓度消毒剂中，混匀，于加入菌液后5、10、15、30、60min 从菌药混合物中取0.5mL 加入到4.5mL 中和剂中，混合均匀后作用10min。取中和作用后的溶液0.5mL 加入到4.5mL 营养肉汤中，混合均匀后置于37℃温箱内培养，观察结果，以PBS 代替消毒剂，其它操作同上述步骤，作为阳性对照组，同时设培养基对照（P），每种菌的定性试验均重复3 次。培养物发生浑浊即表示有细菌生长，若不变浑浊，应继续培养至第7d，若仍不浑浊方可判为无菌生长。以无菌生长管消毒剂的最低浓度为最低杀菌有效浓度，以无菌生长管的最短消毒时间为该浓度杀菌最快有效时间。

3 结果与分析

3.1 稳定性试验结果

过硫酸氢钾复合物粉影响因素试验结果表明消毒剂在光照及高温条件放置后，各指标未见明显变化，但其吸湿性较强，在高湿试验中样品增重达10%，有效氯及氯化钠含量均出现不同程度的下降，具体见表1。过硫酸氢钾复合物粉加速试验结果表明消毒剂在加速条件放置后各指标未见明显变化，结果见表2。

稳定性试验结果表明过硫酸氢钾复合物粉高温、光照试验及加速试验中，pH、干燥失重、氯化钠、外观性状未发生变化，有效氯含量稍有降低，但含量变化在5%范围内，符合规定。另外，过硫酸氢钾复合物粉在高湿条件下发生了严重结块现象，且各质量指标出现显著变化，所以应选择防潮性能较好的包材进行包装。

3.3 消毒效果评价试验

3.3.1 中和剂选择试验结果中和剂选择试验以大肠杆菌8099为指示菌，试验中所用消毒剂的浓度为杀菌试验中使用的最高浓度，即1∶100 稀释，试验结果见表3，由表3 数据可知0.5%硫代硫酸钠可有效中和过硫酸氢钾复合物粉及对照消毒剂的水溶液。

3.3.2 细菌定量试验结果过硫酸氢钾复合物粉及对照产品对大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC6538 的定量杀灭试验结果见表4。由表中数据可知过硫酸氢钾复合物粉及对照产品对两种菌的有效杀菌浓度均为800 倍稀释，过硫酸氢钾复合物粉对金黄色葡萄球菌ATCC6538 的杀菌效果略优于市售进口产品。

表1 过硫酸氢钾复合物粉影响因素试验结果

表2 过硫酸氢钾复合物粉加速试验结果

表4 过硫酸氢钾复合物粉及其对照产品对不同菌株的定量杀灭试验结果

表3 中和剂选择试验结果

3.3.3 细菌定性试验结果过硫酸氢钾复合物粉及对照产品对大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC6538 的定性试验结果见表5。由表中数据可知过硫酸氢钾复合物粉对及对照产品大肠杆菌8099 的最低有效浓度均为1,600 倍稀释，该浓度的最短作用时间均为60min；过硫酸氢钾复合物粉及对照产品对金黄色葡萄球菌ATCC6538 的最低有效浓度均为1,600 倍稀释，该浓度的最短作用时间均为30min。

4 讨论

过硫酸氢钾复合物粉是一种高效、安全、环保、稳定、持久的消毒剂，可有效杀灭9 种动物冠状病毒。近期，在防控新型冠状病毒肺炎疫情过程中，该消毒剂多次被紧急批准用于疫情的防控工作。该产品的质量是否可靠直接关系到它能否在生物安全防控中发挥应有的作用，因此开发质量确切的产品对卫生防范及生物安全防控具有重大意义。

稳定性试验结果显示过硫酸氢钾复合物粉吸湿性强，对湿度较敏感，在高湿度环境中会发生严重结块，进而导致消毒剂有效成分快速下降，产品开发过程应密切关注包材筛选工作，杜绝临床使用中因包材问题引起产品质量下降。

消毒效果试验数据显示过硫酸氢钾复合物粉对大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC6538 均具有较好的杀灭作用。当过硫酸氢钾复合物粉800 倍稀释时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的杀菌率均为100%，其杀菌效果略优于市售进口产品，且优于文献[8-10]报道的研究结果，造成该结果的原因可能是由消毒剂制备工艺不同造成。

综上所述，文中制备的过硫酸氢钾复合物粉稳定性较优，对大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC6538 的杀菌效果与市售进口产品一致，后续可参考该试验结果对产品的放大工艺参数进行研究，使产业化产品与实验室小试样品的质量及效果保持一致。█

表5 过硫酸氢钾复合物粉对不同菌株的定性杀灭试验结果