含齐墩果酸和熊果酸全草类中药的HPLC研究

查孝柱 ，毛小明 ，徐 源 ，曹 富 ，查光圣 ，姜 莉

（1.安庆医药高等专科学校药学系，安徽安庆246052；2.安徽光盛农业股份有限公司，安徽安庆246632；3.安徽医科大学第二附属医院药学部，安徽合肥230001）

齐墩果酸（Oleanolic Acid，OA）和熊果酸（Ursolic Acid，UA）均为五环三萜类化合物，是多种中药含有的活性成分，具有保肝、消炎、抗肿瘤、降血脂、增强免疫和抑制免疫等作用［1-2］。目前这2种物质还只能从植物中提取，无法化学合成，其检测方法有分光光度法［3］、薄层扫描法［4］和高效液相色谱法［5-8］。

本课题组将前期含齐墩果酸、熊果酸10种果实类的HPLC-PDA分析建立了方法，但是含齐墩果酸、熊果酸全草类中药能否用所建立的方法进行分析、常见的全草类中药含齐墩果酸、熊果酸的含量及分布情况、全草类中药能否作为提取齐墩果酸或者熊果酸的原料药等问题还鲜见报道。

本研究以马鞭草、泽兰、连钱草以及白花蛇舌草为研究对象，对常用含有齐墩果酸和熊果酸4种全草类中药材进行了HPLC-PDA研究，并对含量测定结果进行鉴定比较与分析，为齐墩果酸和熊果酸的提取以及相关中药的质量控制鉴别提供一定的依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

仪器分别为：Agilent1100高效液相色谱仪（包括G1311A泵、G1322脱气机、G1313AZ自动进样器、G1313A柱温箱、G1315 DAD及ChemStation色谱工作站）、BP221D电子天平（德国Sartorius公司）以及超声波清洗器等。

1.2 材料

实验所用药材样品来自安庆医药高等专科学校药学系，经安庆医药高等专科学校姚绳林副教授鉴定，齐墩果酸（批号：110709-200304）和熊果酸（批号：110742-200516）对照品购自中国药品生物制品检定所，水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱

1）Shim-pack CLC-ODS （M）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2） 流动相为甲醇-水-冰乙酸-三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05）；3）检测波长为 210 nm；4）柱温 20 ℃；5）进样量 20 μL；6）理论塔板数按齐墩果酸峰计应不低于7 000；7）齐墩果酸与熊果酸色谱峰及其相邻峰分离度大于1.68。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品和熊果酸对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含齐墩果酸0.108 mg和熊果酸0.103 mg的混合对照品溶液，摇匀。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取样品（马鞭草、泽兰、连钱草以及白花蛇舌草）细粉各约0.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，用25 mL移液管精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声提取（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过。

2.4 含量测定

取临床常用的含有齐墩果酸和熊果酸的4种全草类药材，按2.3项下制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进行测定，采用外标法计算含量，结果如表1所示。齐墩果酸和熊果酸对照品液HPLC如图1所示。图1中a为齐墩果酸，b为熊果酸。

表1 4种全草类中药中齐墩果酸和熊果酸的百分含量（n=2）

图1 齐墩果酸和熊果酸对照品溶液HPLC

3 讨论

3.1 不同全草类中药中齐墩果酸和熊果酸含量比较

表1表明，4种全草类中药中都同时存在齐墩果酸和熊果酸，但含量高低存在明显差异。

马鞭草和泽兰齐墩果酸、熊果酸总含量较高，齐墩果酸含量最高的是白花蛇舌草，熊果酸含量最高的是马鞭草。因此，以提取齐墩果酸为目的，可以选择白花蛇舌草；以提取熊果酸为目的，可以选择马鞭草；以提取总三萜酸为目的，可以选择马鞭草和泽兰。

本实验的数据还有待进一步考察不同品种、产地、采收时间及炮制方法等因素的影响，研究的中药材有待加大样品批次进一步研究。

3.2 不同全草类中药HPLC色谱图比较

泽兰、马鞭草、连钱草及白兰蛇舌草4种全草类中药材HPLC如图2所示。

图2显示，在所用的提取、分离和检测条件下，4种所测的全草类中药材除了有齐墩果酸和熊果酸峰之外，各色谱图中峰数、峰位和峰强度表现出一定的可区分性，可用该方法鉴别这4种全草类药材，各样品的鉴别特征有待增加同种样品批数作进一步研究。

图2 4种全草类中药材HPLC

3.3 色谱条件的选择

在对全草类中药材齐墩果酸与熊果酸的分离检测中发现，分别对流动相（甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水），缓冲对（氢氟酸、磷酸、冰乙酸、三乙胺），检测波长（200、205、210、215、220 nm），流速（0.4、0.6、1 mL/min）进行考察，最终确定最佳的色谱条件为：流动相甲醇-水、缓冲对冰乙酸、三乙胺、检测波长210 nm、流速0.6 mL/min。

实验表明，在所确定最佳的色谱条件下，齐墩果酸与熊果酸之间分离度均较好（R＞1.68）；理论塔板数按齐墩果酸峰计应不低于7 000，也达到规定要求；齐墩果酸和熊果酸的保留时间分别为27.9和29.3 min。

3.4 提取条件的选择

在对全草类中药材齐墩果酸、熊果酸提取的过程中，分别考察了不同溶剂（甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚）、不同体积比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）、不同提取方式（回流、索氏提取、超声、冷浸）、不同提取时间（10、20、30、40、50 min），最终确定全草类中药齐墩果酸、熊果酸的最佳提取工艺为：取约0.5 g马鞭草、泽兰、连钱草以及白花蛇舌草粉末，用25 mL甲醇提取30 min。

4 小结

本研究采用反相高效液相色谱法建立了全草类中药材齐墩果酸与熊果酸含量的测定鉴定方法，该方法操作简便、快速，结果准确，可作为全草类中药齐墩果酸、熊果酸含量的测定鉴定方法。从测定结果来看，建议如果以提取齐墩果酸为目的时就选择白花蛇舌草，如果以提取熊果酸为目的时就选择马鞭草，如果以提取总三萜酸为目的时就选择马鞭草和泽兰。