鸡miRNA let-7b前体区单核苷酸多态性与生长肉用性状关联分析

毕圣群，岳孝亭，许嘉慧，张绮琼，杨昌盛，张宇玲，张如涛，周荣灿，林树茂

（佛山科学技术学院动物科学系，广东佛山528000）

miRNA是一类长约18～25 nt（大约22 nt）的小分子单链非编码RNA，是一类重要的转录后调控因子（Post transcriptional regulatory factor），在细胞的增殖、分化、凋亡以及个体成长发育、机体营养代谢等过程中扮演重要角色［1-3］。

自REINHART等［4］在2000年初次在线虫中发现let-7以来，现已成为miRNA研究领域中最为普遍的一种。let-7具有高度时序性、组织特异性、保守性等特点，在细胞的分化、增殖、凋亡和癌细胞的浸润过程中具有重要作用。研究发现，miRNA let-7是癌症治疗和免疫反应的关键参与者，具有作为新的免疫治疗靶标的潜在作用［5］。最近的研究结果确定let-7家族是调节B细胞抗体产生和巨噬细胞反应的关键因素［6］。

研究表明，let-7b作为let-7家族的重要成员，对鸡的生长发育以及骨骼肌的形成发挥着十分重要的作用［7-9］。有研究表明，位于miRNA前体区的单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）很可能会对miRNA的生成加工过程造成不同程度的影响，从而改变成熟miRNA产量，进而影响miRNA对靶基因的调控作用［10］。2007年DUAN等［11］对位于miR-125a前体区的单个SNP进行了详尽的研究，随后发现该SNP不仅能够影响pri-miRNA到pre-miRNA的加工过程，并且会影响miR-125a对其靶基因发挥的调控作用。

本研究以杏花鸡和隐性白洛克鸡杂交所得F2代肉鸡生长性状和肉用性状资料为研究素材，对let-7b前体区SNP多态位点（rs 71292045、rs 71292453）不同基因型与鸡的生长肉用性状（活重LW、胫长SL、胸宽CW、胸深CD、体斜长BSL、胸角CA、屠体重DW、胸肉重BMW、腿肉重LMW、腿肌率LWR、胸肌率BMR、腿胸比RLB等）的影响进行关联分析，旨在进一步探讨let-7b对鸡的生长发育和肉用性状的调控作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本研究采用的实验动物为杏花鸡和隐性白洛克鸡杂交得到的F2代肉鸡。隐性白洛克鸡是一种快大型肉鸡，而杏花鸡是中国广东本土的地方品种肉鸡。在相同的饲养管理条件下，将上述F2代资源群放置于华南农业大学动物科学院种鸡场，采用平养的饲养方式，饲喂符合国际配方标准的玉米—豆粕型饲料。

1.2 测定指标

对资源群在饲养到3月龄时进行屠宰取样，测量的数据包括活重LW、胫长SL、胸宽CW、胸深CD、体斜长BSL、胸角CA等体尺指标，并测定和计算以下屠体性状：屠体重DW、胸肉重BMW、腿肉重LMW、腿肌率LWR、胸肌率BMR、腿胸比RLB等。测定方法如下：

活重LW：指在屠宰前停饲12 h后的重量；

胫长SL：胫部上关节到第三、第四趾间的直线距离；

胸宽CW：用卡尺度量两肩关节间距离；

胸深CD：用卡尺度量第一胸椎至胸骨前缘间的距离；

体斜长BSL：用皮尺测量锁骨前上关节到坐骨结节间的距离；

胸角宽CA：用胸角器在龙骨前缘测量两侧胸部角度；

屠体重DW：禽体放血、拔毛后的重量（湿拔法需沥干）；

胸肉重BMW：将屠体胸肌剥离下的重量；

腿肉重LMW：将禽体腿部去皮，去骨的肌肉重量；

腿肌率LWR：腿肌重/全净膛重×100%；

胸肌率BMR：胸肌重/全净膛重×100%；

腿胸比RLB：腿肉重/胸肉重×100%。

1.3 SNP突变位点基因型频率与基因频率计算

通过PCR扩增和测序，筛选出let-7b基因前体区的SNP多态性，并在此基础上计算出杏花隐性白F2代全同胞家系资源群中各位点的基因型频率和等位基因频率。

1.4 数据分析

试验数据在Excel中建表录入数据并计算平均值、标准差，采用统计分析软件SPSS 20.0对各项指标进行单因素方差分析和多重比较。

2 实验结果

2.1 let-7b前体区SNP多态位点的基因型和基因频率

通过PCR扩增和测序，在let-7b基因前体区筛选出2个SNP，包括rs71292045和rs71292453。其中SNP位点rs71292045对应的基因型为AA、GA、GG，SNP位点rs71292453对应的基因型为TT、TC、CC，上述SNP位点的基因型频率、基因频率见表1。

表1 let-7b前体区SNP多态位点的基因型和基因频率

由表1可知，突变位点rs71292045的基因型AA、GA、GG的基因型频率分别为0.11、0.35、0.54，基因频率A为0.28，G为0.72；突变位点rs71292453的基因型TT、TC、CC的基因型频率分别为0.38、0.31、0.31，基因频率T为0.54，C为0.46。由此可知两个突变位点rs71292045和rs71292453的优势基因型分别是GG和TT。

2.2 let-7b前体区SNP位点rs71292045不同基因型与生长肉用性状关联分析

杏花鸡×隐性白洛克鸡F2资源群let-7b前体区SNP位点rs71292045不同基因型与生长肉用性状的关联分析结果见表2。

表2 let-7b前体区SNP位点rs71292045不同基因型与生长肉用性状关联分析

由表2可知，该位点不同基因型AA、GA、GG的胸肌率分别为6.70%、7.05%、6.68%，差异极显著（P＜0.01），GA极显著高于AA、GG；各基因型的腿胸比分别为1.32%、1.24%、1.30%，差异极显著（P＜0.01），AA极显著高于GA。

结果显示，该位点不同基因型的宰前活重、胫长、胸宽、胸深、体斜长、胸角宽、屠体重、胸肉重、腿肉重、腿肌率等差异不显著（P＞0.05）。不同基因型AA、GA、GG的3月龄活重分别为1.57 kg、1.48 kg、1.50 kg，存在一定差异，但差异不显著（P＞0.05），没有统计学意义；各基因型的胫长分别为86.38 mm、86.57 mm、86.57 mm，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的胸宽分别为 67.44 mm、66.48 mm、66.15 mm，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的胸深分别为 95.30 mm、95.16 mm、95.18 mm，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的体斜长分别为23.25 cm、22.90 cm、22.77 cm，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的胸角分别为60.33°、59.74°、60.41°，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的屠体重分别为 1373.96 g、1317.17 g、1328.13 g，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的胸肉重分别为 91.37 g、91.89 g、88.18 g，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的腿肉重分别为120.856 g、113.538 g、114.718 g，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的腿肌率分别为8.76%、8.64%、8.64%，差异不显著（P＞0.05）。

2.3 let-7b前体区SNP位点rs71292453不同基因型与生长肉用性状关联分析

杏花鸡×隐性白洛克鸡F2资源群let-7b前体区SNP位点rs71292453不同基因型与生长肉用性状的关联分析结果见表3。

表3 let-7b前体区SNP位点rs71292453不同基因型与生长肉用性状关联分析

由表3可知：该位点不同基因型TT、TC、CC的胸肉重分别为85.02 g、93.78 g、92.51 g，差异极显著（P ＜ 0.01），TC、CC 显著高于 TT；各基因型的腿肉重分别为 111.31 g、115.03 g、120.71 g，差异显著（P＜0.05），CC显著高于TT；各基因型的腿肌率分别为8.52%、8.55%、8.93%，差异极显著（P＜0.01），CC极显著高于 TT、TC；各基因型的胸肌率分别为 6.54%、7.07%、6.88%，差异极显著（P＜0.01），TC、CC极显著高于CC；各基因型的腿胸比分别为1.31%、1.22%、1.31%，差异极显著（P＜0.01），TT、CC极显著高于TC。

统计结果表明，该位点不同基因型对宰前活重、胫长、胸宽、胸深、体斜长、胸角宽、屠体重等差异不显著（P＞0.05）。不同基因型 TT、TC、CC 的 3 月龄活重分别为 1.46 kg、1.50 kg、1.54 kg，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的胫长分别为 85.76 mm、86.98 mm、88.21 mm，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的胸宽分别为 65.41 mm、67.05 mm、67.27 mm，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的胸深分别为 94.30 cm、96.87 cm、94.77 cm，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的体斜长分别为 22.67 cm、22.92 cm、23.12 cm，差异不显著（P＞0.05）；各基因型的胸角分别为 60.10°、60.05°、60.41°，差异不显著（P=0.891）；各基因型的屠体重分别为 1 306.10 g、1 342.67 g、1 356.12 g，差异不显著（P＞0.05）。

3 分析与讨论

有研究表明，鸡miRNA let-7b可通过靶向调控IGF2BP3 mRNA和蛋白质表达水平来影响鸡成肌细胞的增殖［12］。同时也有研究发现，let-7b可通过调控GHR基因的表达，影响SLD鸡骨骼肌发育过程［7］。研究显示，位于miRNA上的SNP位点的不同基因型对动物的生长性状存在一定的相关影响和调控作用。猪（Sus scrofa）的每窝产仔数与位于miR-27a基因上的T/C碱基位点突变有关［13］；HONG等研究了位于猪miR-1基因上的两个SNP，结果显示，这两个SNP不仅能够降低前体区的miR-1与成熟miR-1的基因表达，而且与猪肉Ⅰ型与Ⅱ型肌纤维的组成和数量的比例呈显著相关［14］。

为了进一步观察miRNA let-7b不同SNP位点不同基因型对鸡生长肉用性状的影响和调控作用，本研究以华南农业大学前期采用广东省优质地方肉鸡品种杏花鸡与快大型肉鸡隐性白洛克进行杂交所得到的F2代肉鸡的生长性状和肉用性状资料为研究素材，通过关联分析发现let-7b前体区两个SNP多态位点（rs712920451和rs71292453）不同基因型对生长肉用性状存在不同程度的影响。通过统计分析，发现SNP多态位点rs71292045不同基因型与生长肉用性状中的胸肌率、腿胸比呈显著相关，其中胸肌率的优势基因型是GA，腿胸比的优势基因型是AA；SNP多态位点71292453不同基因型与鸡的胸肉重、腿肉重、腿肌率、胸肌率、腿胸比呈显著相关，其中胸肉重的优势基因型是TC，腿肉重的优势基因型是CC，腿肌率的优势基因型是CC，胸肌率的优势基因型是TC，腿胸比的优势基因型是TT。

胸肉重、腿肉重是衡量肉鸡生产性能的重要经济性状，胸肌率、腿肌率、腿胸比等也是评价肉鸡经济性状的重要指标。因此，如何选育胸肉、腿肉重高且胸肌率、腿肌率、腿胸比适宜的肉鸡品种是育种研究的重要内容。

综合以上结果来看，鸡的miRNA let-7b前体区单核苷酸多态性（SNP）位点对鸡的生长肉用性状具有一定影响，其中对于胸肉重、腿肉重、胸肌率、腿肌率、腿胸比这5个肉用性状的影响较为突出，通过以上实验结果说明，在肉鸡选育过程中选择合适的优势基因型对于肉鸡的生长发育会产生积极的正面影响，对促进肉鸡的快速生长和肉量的稳定提高，改善鸡的生产性能和肉用经济性状具有重要意义。但从实验结果看，miRNA let-7b前体区单核苷酸多态性（SNP）位点不同基因型是如何调控肉用性状的变化，其作用机理尚不明确，还需进一步的研究与探讨。

4 小结

通过实验与数据分析，发现鸡的miRNA let-7b前体区单核苷酸多态性（SNP）位点不同基因型与鸡的生长肉用性状（胸肉重、腿肉重、胸肌率、腿肌率、腿胸比）存在显著的关联，提示rs71292045和rs71292453两个位点在鸡的生长发育过程中扮演重要角色。本研究结果可为提高和改善鸡的肉用经济性状的选育效果提供一定的参考依据。