艾叶油对小鼠肝脏生物钟基因Bmal1、Clock mRNA时辰变化的影响

2020-11-19保彩秀佟海英黄先菊

中国民族民间医药 2020年19期

敖舟保彩秀张露佟海英黄先菊*

1.中南民族大学药学院，湖北武汉 430074；2北京中医药大学中医学院，北京 100029

艾叶(Artemisiae argyi)是菊科植物艾的干燥叶，广泛应用于治疗各种炎症、疼痛、妇科疾病、胎动、月经不调等[1]。在中医理论中，“阴”和“阳”是用以辨证施治的相对的哲学概念。艾叶性温且干，略有升浮之性[2],属于“阳”性药；因此，可以用来调理“阴”性病症比如虚弱、衰老等。早在19世纪，西方科学家就已经发现药物的服药时间影响其治疗作用，不同类型药物的最佳给药时间也各不相同[3]。现代研究证明，人体的生理变化具有生物周期性，在生物钟的控制调节下，人体的基础代谢、体温变化、新陈代谢、血糖含量和激素分泌等功能都具有节律性和峰谷值，致使药物在吸收、分布、代谢和排泄等方面也成相应改变[4]。因此，正确依据时辰给药，可以实现以最小剂量，达到最佳疗效，最小毒性的治疗效果[5]。

现已发现许多哺乳动物体内存在大量的日节律基因。其中有些基因参与生物钟的调控,这些基因的改变可引起生物节律的异常，这些对维持生物体节律起关键性作用的日节律基因称为钟基因[6]。Clock和Bmal1为钟基因的转录提供了最基本的动力[7]。在生物钟基因调控的辅助环路-PAR蛋白复合体与E4BP4蛋白形成的辅助调节环路中：Bmal1和Clock的异源二聚体使DBP基因表达增加, 增加的DBP使 Bmal1/Clock 对 Per1/2 诱导转录的效率增强。相反,E4BP4则使Bmal1/Clock对Per1/2诱导转录的效率下降。因此, 在白天时，Bmal1/Clock被DBP诱导，从而促进Per转录表达；而在夜间将近时，Bmal1/Clock被E4BP4抑制，从而抑制Per转录表达[8]。在哺乳动物视交叉上核(SCN)中，Clock基因呈微弱的近日节律，在白天时量稍多，晚上时量略少，但是全天的表达水平相对比较恒定[9]。

本实验旨在研究艾叶早晚给药对小鼠的生理节律的影响，分析艾叶精油对小鼠肝脏Bmal1和Clock生物钟基因的影响，从而探索其临床治疗时辰规律，建议最佳用药时间。

1 材料与方法

1.1 实验材料艾叶采自于湖北蕲春市，经中南民族大学药学院洪宗国教授鉴定。样品(NO.S20180530)已存放于药学院的植物标本室。艾叶精油由本院洪宗国教授制备[2]，产率约为0.607%～0.953%，其主要成分为萜类化合物及其氧化物的混合物如4-萜烯醇、1，8-桉油脑、樟脑、龙脑等[10](如图1所示)。临用前以橄榄油稀释10倍备用。根据预实验及文献参考临床安全用量，本研究中给药剂量为0.5 mL/kg。其他试剂均为分析纯。

图1 艾叶精油中主要成分的化学结构

1.2 动物实验 48只昆明小鼠(18～22 g)，♀♂各半，购自湖北省实验动物中心。动物饲养在温度(22±2)℃，12 h光照循环的房间中。将小鼠随机分为8组，每组♀♂各3只。选取不同的时间，连续7 d腹腔注射给药，在此期间，观察记录小鼠的临床表现，并持续记录小鼠的体重变化。最后一次给药后，分别在10:00和22:00处死小鼠，取肝脏组织约50～100 mg放入Trizol液中低温冻存。具体实验方案如图2所示。

A1：雌雄各半，10:00给药,10:00取样；A2：雌雄各半，10:00给生理盐水，10:00取样；A3：雌雄各半，22:00给药，10:00取样；A4：雌雄各半，22:00给生理盐水，10:00取样；B1：雌雄各半，10:00给药，22:00取样；B2：雌雄各半，10:00给生理盐水，22:00取样；B3：雌雄各半，22:00给药，22:00取样；B4：雌雄各半，22:00给生理盐水，22:00取样。

1.3 实时荧光定量 RT-PCR 法检测采用实时荧光定量 RT-PCR 方法，以β-actin作为参照基因，检测Bmal1、Clock生物钟基因的相对表达水平。Trizol试剂从细胞中提取总RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，Master Mix10 μL 分别为 PrimerScript RT Enzyme Mix I(1.0 μL)、 RT Primer Mix×4(1.0 μL)、5×PrimeScript Buffer 2(for Real-time)(4.0 μL)、RNase Free dH2O(4.0 μL)，逆转录反应的总体积为 20 μL，逆转录反应体系为 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。进行 PCR 反应，取 cDNA 2μL，TB Green Primix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各 0.8 μL，Rox Reference Dye or DyeⅡ(50×)0.4 μL，PCR 反应总体积为 20 μL。使用以下扩增体系进行 PCR 扩增：Stage1 中先将 DNA 聚合酶在 95 ℃预热变性 30 s，Stage2 在循环体系 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～40 s中循环 40 次。引物序列见表1。

表1 RT-PCR相关引物列表

1.4 统计方法采用Graphpad-prism-8.3进行统计分析，研究结果以均数加减标准差表示，采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床观察整个给药过程中至实验结束，各组小鼠均活动正常，体重呈稳步增加的趋势(数据未显示)。在给与艾叶油后，部分小鼠出现给药部位暂时局部刺激症状，但一般在给药后两天内消失，且无异常表现。

2.2 艾叶油可显著上调Bmal1、Clock基因mRNA表达对照组小鼠Bmal1、Clock基因mRNA早晚表达比较平稳，与上午10∶00对比，晚上22∶00的Bmal1基因水平约为其0.85倍；Clock基因水平约为其1.11倍。艾叶油对Bmal1和Clock基因的影响效果基本一致。从图3和图4中可以看出，艾叶油可显著上调Bmal1、Clock基因mRNA表达，且上午给药比晚上给药mRNA相对表达水平更高。表明艾叶油此类“助阳”药的最佳给药时辰为上午。

图3 艾叶油对Bmal1基因 mRNA表达的影响注：与对照组相比，*P<0.05、**P<0.01；两组之间相比，#P<0.05、##P<0.01。

图4 艾叶油对Clock基因 mRNA表达的影响注：与对照组相比，*P<0.05、**P<0.01；两组之间相比，#P<0.05、##P<0.01。

2.3 雌雄之间Bmal1和Clock基因mRNA的表达差异为了进一步探讨性别对生物钟基因的影响，雌雄Bmal1和Clock基因 mRNA表达比例将与对照组相比。从图5和图6中可以看出，上午给药的雄雌鼠Bmal1和Clock基因mRNA表达比例更高，差异更显著；晚上给药的雄雌鼠mRNA表达差异较小。表明艾叶油上午用药对机体生物钟基因的扰动较大，且艾叶油对不同性别的动物生物钟基因的调控有一定程度的差异，雄性比雌性对艾叶油更敏感。

图5 艾叶油对雄/雌之间Bmal1基因mRNA表达差异的影响注：与对照组相比，*P<0.05、**P<0.01。

图6 艾叶油对雄/雌之间Clock基因mRNA表达差异的影响注：与对照组相比，*P<0.05、**P<0.01。

3 讨论

生物的生命活动受昼夜节律的影响，生物的许多生理功能都具有明显的昼夜节律。人体生理节律引起的体内药物浓度变化与药物的治疗效果密切相关[11]。生物钟核心基因Bmal1和Clock是哺乳动物生命活动中最重要的中央时钟元件之一，其突变可引起生物节律系统紊乱，甚至导致肿瘤的产生[12]。疾病的发生和临床用药都与昼夜节律有关。许多疾病都有昼夜波动，如哮喘、心绞痛、胃酸分泌、偏头痛、癫痫、癌症、关节炎和风湿病。另一方面，疾病的昼夜节律也会引起治疗药物的药代动力学和药效学的昼夜节律变化[13]。根据昼夜节律，定时给药是中医时间疗法的特点之一。中国古人已经发现，在自然环境周期性变化的影响下，会发生人体阴阳的消长昼夜变化[14]。因此，应根据昼夜节律增减药物，以达到最佳效果。

本实验结果表明，艾叶油给药可以促进小鼠生物钟核心基因Clock、Bmal1的表达，从而改变小鼠的昼夜节律。在不同时间点对生物钟基因Clock、Bmal1的昼夜节律有明显不同的影响。在10∶00给药比在22∶00点给药mRNA相对表达量更高，说明小鼠在早上对艾叶油更敏感，药效更好。本实验充分验证了白天是服用助阳药药效最佳时辰的理论，即艾叶油在早上使用效果更好。按照中医理论，白天9点到13点之间是阳气最盛的时候，疾病在病人的抵抗力的帮助下更容易治愈[15]。因此，只有在用药时机与机体节律变化相一致的情况下，才能充分调动机体的积极免疫因素，提高药物疗效，甚至减少不良反应的发生。

此外，不同性别对药物的反应性也有所不同。本研究表明，艾叶油对雌性和雄性小鼠的生物钟基因表达水平有一定程度的差异。雄性小鼠对艾叶油的敏感性略微高于雌性小鼠，对临床用药具有一定的参考意义。