穴位强化埋线疗法对STC患者直肠组织中ICC和神经元细胞的调节

谢振年 安晓静 杨斌 李东冰 王芳丽 苗春红 冷涛 贾小强 赵卫兵 曹威巍 权隆芳 原小千 崔春晖

摘要 目的：探究穴位强化埋线疗法对慢传输型便秘（STC）直肠组织中ICC细胞和神经元的调节。方法：选择STC患者41例，非便秘患者41例，分别设置为观察组和对照组。观察组给予穴位强化埋线疗法，对照组未给予便秘相关治疗。比较观察组治疗前后直肠组织中ICC细胞形态、相关蛋白干细胞因子（STem Cell FacTor，SCF）和c-kit mRNA的表达水平和神经元凋亡情况。结果：观察组患者经穴位强化埋线治疗后直肠组织中ICC细胞的数量较治疗前增加，且形态趋于正常。与对照组比较，SCF和c-kit mRNA在治疗前直肠组织中的表达明显降低（P<0.05，P<0.01），而在治疗后直肠组织中的表达要高于治疗前（P<0.01）。治疗前，观察组患者直肠组织内神经元凋亡数量多于对照组（P<0.01）。治疗后患者直肠组织内凋亡细胞明显减少，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：穴位强化埋线可改善STC患者直肠组织中ICC细胞的损伤，并减少神经元细胞的凋亡发生，从而改善便秘症状。

关键词 穴位强化埋线;慢传输型便秘;Cajal間质细胞;干细胞因子

Academy of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100091， China; 3 Department of General Surgery， Aerospace Center Hospital， Beijing 100083， China; 4 Beijing Anorectal Hospital， Beijing， 102401， China; 5 Department of Anorectal Surgery， Pinggu District Hospital of Traditional Chinese Medicine， Beijing 101200， China）

Abstract Objective：To explore the regulation of acupoint intensive catgut embedding therapy on ICC cells and neurons in rectal tissue of slow transit constipation （STC）. Methods：A total of 41 STC patients and 41 non-constipation patients were selected as the observation group and control group， respectively. The patients in treatment group were given acupoint intensive catgut embedding therapy， while the control group did not receive any constipation related treatment. The morphological of ICC and the expression of SCF and c-kit on RNA were compared before and after treatment in the treatment group. Results：The number of ICC in the rectum tissue increased with the normal morphology after treatment. Compared with the control group， both SCF mRNA and c-kit mRNA in the rectum were significantly lower without treatment （P<0.05， P<0.01）. The expression in rectal tissue after treatment was higher than before treatment （P<0.01）. Before treatment， the number of neuronal apoptosis in the rectal tissue of the observation group was more than that of the control group （P<0.01）. After treatment， the apoptotic cells in the rectal tissue of the patients were significantly reduced， which was significantly different from the control group （P<0.05）. Conclusion：Acupoint intensive catgut embedding therapy can improve the injury of ICC cells in rectal tissues of STC patients， reduce the apoptosis of neuron cells and improve the symptoms of constipation.

Keywords Acupoint intensive catgut embedding; Slow transit constipation; Interstitial cells of Cajal; Stem cell factor

中图分类号：R266;R245.9+1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.025

资料显示全球成人慢性便秘发病率为2.5%～79%[1]，而在我国发病率约为6%。其中慢传输型便秘（Slow Transit Constipation，STC）占所有类型便秘的16%～40%，约占功能性便秘的45.5%[2]。对于STC的治疗目前仍以对症治疗为主，尚无其他有效方法。STC的发病机制尚不明确。多数研究认为位于肠道肌层内的Cajal间质细胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）是一种发挥起搏作用的细胞，维持了胃肠动力[3]。现代研究显示干细胞因子（STem Cell FacTor，SCF）/c-kit信号通路对维持ICC的正常功能中发挥重要作用[4]。我们临床上采用穴位强化埋线治疗STC，取得较好的疗效[5-6]。因此，本文就穴位强化埋线是否通过SCF/c-kit信号通路调节了ICC的功能展开研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2011年4月至2013年4月中国中医科学院西苑医院收治的符合纳入标准和排除标准的慢传输型便秘患者和非便秘患者82例作为研究对象，按照随机对照方法分为对照组（非便秘组）和观察组（慢传输型便秘组），每组41例，对照组中男2例，女39例，年龄38～74岁，平均年龄（56.75±10.01）岁，病程2～38年，平均病程（37.87±11.69）岁;观察组中男1例，女40例，年龄35～72岁，平均年龄（55.53±9.83）岁，病程1～40年，平均病程（38.56±12.87）年。2组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。此研究方案已通过中国中医科学院伦理委员会批准（伦理审批号：2010XL072-2）。

1.2 纳入标准

1.2.1 对照组纳入标准 1）年龄在30～75岁之间;2）意识清楚，配合治疗;3）心血管和脑血管疾病、代谢疾病和其他系统性疾病处于稳定期;4）签订知情同意书。

1.2.2 观察组纳入标准 符合对照组纳入标准的同时，符合按照罗马III结肠慢传输性便秘的诊断标准;已停止参加其他便秘的临床试验1个月以上。

1.3 排除标准 1）出口梗阻型及混合型便秘患者;2）严重脏器功能障碍和严重糖尿病者;3）孕妇和哺乳期妇女;4）独立活动严重受限患者;5）肠道器质性梗阻或伴肠道运动异常的其他疾病患者。

1.4 治疗方法

1.4.1 对照组 未给予治疗便秘的干预措施。

1.4.2 观察组 1）穴位处方：天枢、气海透关元透中极、大肠俞、足三里（腧穴定位依据2000年孙国杰主编的第六版教材《针灸学》）;2）穴位强化埋线的概念：选用双股可吸收羊肠线（吸收慢、体积大）（山东博达医疗用品有限公司，型号：2号），每股羊肠线长度在4 cm左右，在同一穴位重复埋线3次。埋线深度要求达到肌层，目的是加强对穴位的刺激作用，故将此操作方法称之为穴位强化埋线。3）具体操作方法：常规碘伏（北京洗得宝消毒制品有限公司，20120603）消毒后，采用局部麻醉的方法，利用硬膜外穿刺针将长约4 cm的羊肠线1根埋入足三里穴約5 cm，再用医用缝合针（规格为13 mm×55 mm）将长约4 cm的双股羊肠线埋入上述其余穴位肌层中并重复埋线3次，线体不可外露，局部敷料包扎。

1.5 标本采取 1）对照组：非便秘同时合并混合痔的患者采用吻合器技术采取直肠组织标本。同一患者术后1个月来院复查用活检钳钳取的直肠组织标本。上述新鲜组织取下后即置入液氮冷冻。2）观察组：治疗前采用吻合器技术采取直肠组织标本。同一患者术后1个月来院复查用活检钳钳取的直肠组织标本。上述新鲜组织取下后即置入液氮冷冻。

1.6 实验试剂和仪器 1）试剂：二甲苯（淄博经贸有限公司，批号：20120613）、无水乙醇（北京贞玉民生药业有限公司，批号：201502014）、TRizol（百奥思科，批号：MD959-020）、氯仿（百奥思科，批号：MD4620-020）、异戊醇（百奥思科，批号：MD1962-020）、反转录试剂盒（康为世纪，批号：CW2391）、细胞凋亡试剂盒（欣博盛，批号：FAK011.100）。2）仪器：低温高速离心机（日立，日本，型号：CF16RXⅡ），型电泳仪（上海巴玖实业有限公司，型号：DYY-6C），PCR仪（伯乐，美国，型号：T100），超低温冰箱（三洋，日本，型号：55700-159），烤片机（徕卡，德国，型号：HI1220），正置显微镜（Olympus公司，型号：BX51）等。

1.7 观察时间和指标

1.7.1 观察时间 林琳等[2]报道，慢传输运动小鼠肠组织中Cajal间质细胞等指标在45 d时变化最为明显。我们自2002年开始系统观察慢传输型便秘患者，发现在治疗后1个月时患者的临床疗效最为稳定[7]。前期经穴位强化埋线治疗的15例STC患者的病理观察发现在治疗1个月时Cajal间质细胞数量有明显增加。基于以上依据我们把观察时间定为1个月。

1.7.2 ICC的分布及形态变化 取石蜡切片，70 ℃加热30 min，新鲜二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡15 min脱蜡。将切片依次在无水乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸馏水中浸泡5 min，高温高压抗原修复2.5 min。3%H2O2浸泡10 min消除内源性过氧化物酶，然后放入正常山羊血清37 ℃封闭30 min后，分别加入一抗、二抗试剂进行孵育。DAB显色后，再进行苏木素复染：1%盐酸乙醇分化后，再将切片依次在75%乙醇、85%乙醇、无水乙醇中梯度脱水;随后二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡5 min，封片后显微镜观察。

1.7.3 ICC的数量变化 经正常山羊血清37 ℃封闭30 min，去封闭液，加PBS稀释好的一抗，放湿盒中4 ℃过夜。1×PBS清洗3 min×3次，加二抗试剂，37 ℃孵育20 min。加荧光二抗，1×PBS清洗3 min×3次。DAPI复染10 min，1×PBS清洗3 min×3次。滴加防荧光淬灭剂封片，用荧光显微镜拍照观察。

1.7.4 直肠组织中的c-kit及SCFmRNA表达变化 将获取的直肠组织冷冻标本（约50 mg），手工研磨至粉末状;转入RNA专用的1.5 mL EP管中，每管加入1 mL trizol液，在室温中静置约30 min。提前讲低温离心机预冷，将上述准备的EP管放入离心机中（4 ℃，12 000 r/min，离心半径5 cm）离心5 min，讲EP管取出。转移EP管中上清液至另外准备的EP管中，按0.2 mL/1 mL比例加入氯仿。同样放入低温离心机（4 ℃，12 000 r/min，离心半径5 cm）离心15 min。再次将上层液体转移至EP管中，再等体积加入异丙醇，上下颠倒混匀。再次同样条件离心15 min，弃上清。随后加入1 mL 75%乙醇（提前预冷），充分洗涤沉淀，离心5 min，弃去上清，留沉淀。将反转录获得的cDNA溶液进行按需稀释。加入引物，进行荧光定量PCR检测。

1.7.5 直肠组织中的神经元细胞凋亡的检测 取石蜡切片，70 ℃加热30 min，新鲜二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡15 min脱蜡;将切片依次在无水乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸馏水中浸泡5 min水化;按照凋亡试剂盒说明书进行，并用DAPI复染细胞核;滴加防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察拍照。

1.8 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料采用（±s）表示，组间比较采用2个独立样本t检验，组内比较采用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICC的分布及形态变化 显微镜下观察以细胞呈现棕黄色定义为c-kit蛋白表达阳性。病理形态学显示ICC呈纺锤样或卫星样，带有细长突起，核呈卵圆形。免疫组化显示，与对照组比较，观察组治疗前ICC突起减少，细胞变圆，黏膜下层及肌层中ICC数目均减少。治疗后，观察组ICC突起较前增多，细胞变细长，黏膜下层及肌层中ICC数目增多。见图1。

2.2 ICC的数量变化 免疫荧光染色结果显示黄绿色荧光为c-kit蛋白阳性。结果表明，与对照组比较，观察组治疗前ICC数目明显减少，治疗后，观察组ICC数目较前明显增多。见图2。

2.3 直肠组织中的c-kit及SCF mRNA表达变化 治疗前，观察组c-kit mRNA及SCF mRNA表达均明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。治疗后1个月，观察组c-kit mRNA及SCF mRNA表达较前增加，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.4 直肠神经元细胞的凋亡检测 按照试剂盒说明书，Tunel标记的细胞中有黄绿色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。治疗前，观察组患者直肠组织内可见凋亡细胞明显多于对照组（P<0.01）。治疗后1个月，观察组患者直肠组织内凋亡细胞明显减少，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），但对照组治疗前后无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3，表2。

3 讨论

STC患者常表现为大便次数减少、无便意、排便困难和排便不尽感等。此类患者症状反复发作，经久不愈，已成为影响人们生命质量的重要因素之一[8]。STC发病机制尚不清，目前STC的机制研究主要集中在SCF/c-kit信号通路、肠神经系统、水蛋白通道和胃肠激素变化等方面[9]。由于ICC细胞是胃肠道平滑肌运动的起搏细胞，加之其也是影响胃肠动力的重要细胞，所以ICC功能及形态的变化和SCF/c-kit信号通路与便秘关系研究较多，但穴位强化埋线疗法是否也是调节了SCR/c-kit信号通路，影响了ICC的功能而发挥作用呢？

c-kit（酪氨酸激酶受体）是ICC细胞的特异性标志物，c-kit相对应的配体：SCF对ICC的生长、发育和成熟均具有调控作用[9-10]。SCF/c-kit信号通路是由干细胞因子SCF及其天然配体酪氨酸激酶受体c-kit构成。SCF活化c-kit受体，随后c-kit和SCF形成二聚体，从而活化细胞内的酪氨酸激酶及磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）。随之激活多条信号通路，参与ICC的增殖、分化和表型的维持等[11]。相关研究表明，任何导致c-kit或SCF表达下降及相应的信号通路受阻的致病因素均可能引发ICC表型发生转化，而失去相应的功能，导致形态及功能异常[12]。有文献报道在小鼠体内，编码c-kit基因发生突变及编码kit配体干细胞因子的sl位点发生突变均可引起肠道ICC缺失[13]和肠道慢波的消失。有学者报道c-kit mRNA的表达和c-kit蛋白在STC患者结肠组织中明显减少[14]。提示SCF/c-kit信号通路对ICC生理功能的维持中具有重要的作用。

穴位埋线是基于“久病者，邪气入深，刺此病者，深纳而久留之”的理论基础上发展的一种新型的穴位刺激疗法。该方法起于20世纪60年代。而我們的穴位强化埋线疗法是在传统埋线的基础上加以改进和创新。我们用大号医用缝合针将双股2号羊肠线缝合进相应的穴位并达肌层，每一穴位同时埋线3次，使其阈值迅速达到，充分体现了“深纳而久留之，以治顽疾”的思想。穴位强化埋线过程包含了穴位封闭术、针刺疗法、刺血疗法、组织疗法和割治治疗，同时由于埋线较长时间埋入穴位所带来的埋针效应及后作用效应，本方法将多种治疗手段和效应集中和整合起来，形成了穴位强化埋线独特的治疗效果。