电针对肠易激综合征内脏痛大鼠β内啡肽及脑啡肽的调节作用

纪佳灏 黄作阵

摘要 目的：觀察电针对肠易激综合征（IBS）内脏痛大鼠血清及下丘脑β-内啡肽（β-EP）及脑啡肽（ENK）的调节作用，探讨电针对IBS内脏痛的镇痛效应。方法：制备IBS内脏痛大鼠模型。实验分为模型组、电针组、假电针组和正常组。取天枢和上巨虚穴（双侧）为针刺穴位，针刺后连接电针仪;假电针组进针透皮即止，连接电针仪但不通电。模型组和正常组做与电针组相同的固定，不进行任何治疗。治疗后测试各组大鼠AWR评分，检测血清及下丘脑β-EP及ENK水平。结果：与正常组比较，模型组大鼠AWR评分在各个压力梯度下均显著升高、血清β-EP及ENK水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），下丘脑β-EP、ENK水平差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组、假电针组比较，电针组大鼠AWR评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;血清和下丘脑β-EP、ENK水平显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，假电针组大鼠AWR评分、血清和下丘脑β-EP、ENK水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论：电针有效缓解IBS大鼠内脏痛，其作用机制可能与调节血清和下丘脑β-EP、ENK的水平有关。

关键词 电针;肠易激综合征;内脏痛;大鼠;β-内啡肽;脑啡肽;天枢;上巨虚

Abstract Objective：To observe the regulatory effects of electroacupuncture on serum and hypothalamic β-endorphin（β-EP）and enkephalin（ENK）in rats with IBS visceral pain，and to explore the analgesic effect of electroacupuncture on IBS visceral pain.Methods：The rat model of IBS visceral pain was prepared.The experiment was divided into a model group，an electroacupuncture group，a sham electroacupuncture group and a normal group.Tianshu（S25）and Shangjuxu（S37）acupoints（both sides）was taken as acupuncture points，and the electroacupuncture instrument after acupuncture was connected.The sham electro-acupuncture group stopped when the needle was inserted through the skin，and the electro-acupuncture device was connected but not powered.The model group and the normal group received the same fixation as the electro-acupuncture group without any treatment.After treatment，the AWR scores of each group of rats were tested，and the serum and hypothalamic β-EP and ENK contents were detected by ELISA.Results：Compared with the normal group，the AWR score of the model group was significantly increased under each pressure gradient，the serum β-EP and ENK content were significantly reduced（all P<0.01），and the hypothalamic β-EP and ENK content did not change significantly（P>0.05）.Compared with the model group and the sham electroacupuncture group，the AWR score of the rats in the electroacupuncture group was significantly reduced（P<0.05）; the serum and hypothalamic β-EP and ENK levels were significantly increased（P<0.01，P<0.05）.Compared with the model group，there were no significant changes in the AWR score，serum and hypothalamic β-EP，ENK content of rats in the sham electroacupuncture group（P>0.05）.Conclusion：Electroacupuncture can effectively relieve visceral pain in IBS rats，and its mechanism may be related to the regulation of the contents of β-EP and ENK in serum and hypothalamus.

Keywords Electroacupuncture; Irritable bowel syndrome; Visceral pain; Rats; β-endorphin; Enkephalin; Tianshu（S25）; Shangjuxu（S37）

中图分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.008

肠易激综合征（Irritable Bowel Syndrome，IBS）是临床常见的功能性胃肠疾病，主要症状包括腹痛并伴有排便习惯改变。调查显示，我国人群IBS总患病率达到6.5%，发病高峰年龄段为30～59岁之间[1];亚洲IBS的发病率为2.9%～15.6%，全球10%～20%的人有IBS的临床症状，约11%的成年人群深受其影响[2-3]。目前关于本病的发病机制尚不明确，研究认为其潜在机制主要与中枢神经系统、胃肠道改变、基因易感性、内脏高敏感性、肠道动力异常密切相关，其中尤其与内脏高敏感性密切相关[4-5]。内脏痛（Visceral Pain，VP）是IBS主要表现之一，也是众多患者就诊的主要原因之一。研究认为，外周伤害性感受器和中枢神经元双重敏化是导致内脏痛的病理基础[6]。既往研究显示，针灸对IBS内脏痛具有良好的镇痛作用，并初步揭示了针灸治疗IBS内脏痛的作用机制[7-9]。阿片肽是一种神经活性物质，分为内源性和外源性2种[10]。内源性阿片肽是在体内合成，目前发现的内源性阿片肽主要包括5大家族：脑啡肽、内啡肽、强啡肽、孤啡肽和内吗啡肽，对疼痛具有良好的镇静、镇痛等作用[11]。本研究从阿片肽物质镇痛角度，通过检测大鼠血清和下丘脑中β-内啡肽（β-EP）、脑啡肽（ENK）的水平变化，并进一步探讨电针治疗IBS内脏痛的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 36只出生8 d SD清洁级乳鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001。所有大鼠均在北京中医药大学实验动物中心饲养。平均室温（20±2）℃、平均相对湿度（60±5）%、光照周期12 h（7：00-19：00灯照，19：00-7：00黑暗）。实验符合相关伦理学要求。

1.1.2 试剂及仪器 大鼠β-内啡肽ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，货号：JYM0377Ra）、大鼠脑啡肽ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，货号：JYM0966Ra）。自制球囊;华佗牌一次性无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，规格：0.25 mm×25 mm）;韩式经穴刺激仪（南京济生医疗科技有限公司，型号：HANS-100A）;血压计（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，型号：水银血压计）;医用三通阀（菏泽圣美高分子塑料制品有限公司）;光学显微镜（Olympus，日本，型号：BX53）;酶标仪（Labsystems Multiskan MS公司，芬兰，型号：352型）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 根据Al-chaer[12]实验方法，采用球囊刺激乳鼠直结肠（CRD）制备IBS内脏痛大鼠模型。选择出生8 d的乳鼠，随机分为正常组9只和造模组27只。正常组大鼠仅进行会阴部抓揉，1次/d，连续14 d;造模组大鼠每天予以CRD刺激，方法如下：在球囊表面涂液体石蜡，从肛门缓慢插入约2 cm，到达降结肠部位。球囊充气0.2 mL，持续1 min后缓慢撤气，取出球囊，1 h后重复1次，1次/d，连续14 d。造模结束后，饲养42 d，对所有大鼠进行CRD刺激并进行腹壁撤回反射（AWR）评分。分别予以20 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、40 mm Hg、60 mm Hg、80 mm Hg的结直肠扩张刺激。每只大鼠在每个压力梯度下重复测量3次，每次持续约20 s，2次间隔5 min，取3次均值作为最后评分值。测试结束后，随机选取正常组1只、造模组3只大鼠进行结肠HE染色，确认造模是否成功。

1.2.2 干预方法 剩余24只造模组大鼠随机分为模型组（MG）、电针组（EA）和假电针组（SA），每组8只。将4组大鼠进行相同的固定，电针组取天枢和上巨虚穴（双侧）进行治疗，定位依据《实验针灸学》（李忠仁主编），进针深度均为5 mm，接韩式经穴刺激仪：疏波、频率2 Hz、电流2 mA，30 min/次，1次/d，共7 d;假电针组进针透皮即止，连接电针仪但不通电，每次留针时间及疗程同电针组;正常组及模型组大鼠不做任何治疗。干预结束后对各组大鼠进行AWR评分测试。

1.2.3 取材与处理 大鼠麻醉后，取腹主动脉血液，置于离心管内保存，待取材结束后，于4 ℃离心机内离心提取血清，置于-80 ℃冰箱保存。于降结肠部剪取3 cm结肠组织，置于4%多聚甲醛内固定，用于HE染色及病理觀察。断头后，暴露大脑，取出下丘脑，置于液氮内保存备用。

1.2.4 检测指标与方法 1）大鼠一般情况观察：观察各组大鼠的精神状态、饮食、排便、体质量等。2）行为学检测：AWR评分，AWR评分标准：0分：对CRD无行为反应;1分：刺激开始时大鼠偶有扭头，CRD期间大鼠保持不动;2分：腹肌轻微收缩，无腹肌抬起;3分：腹肌强烈收缩，腹肌抬起，无盆腔及阴囊抬起;4分：身体拱起，盆腔及阴囊抬起。3）结肠组织病理学观察：将置于4%多聚甲醛溶液中的结肠取出，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，采用苏木精-伊红（HE）染色后观察结肠组织病理学变化。4）大鼠血清和下丘脑β-EP、ENK水平的检测：将已制备好的血清和下丘脑提取上清液，参照说明书，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）按试剂盒操作，测定大鼠血清和下丘脑中β-EP、ENK水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理。对数据做正态分布和方差齐性检验，符合正态分布采用均数±标准差（±s）表示;偏态分布时采用中位数表示。正态分布组采用单因素方差分析，方差齐采用最小显著差法（LSD）比较组间差异性;方差不齐时用Games-Howell比较组间差异性。若资料不服从正态分布，采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠一般情况 正常组大鼠精神状态良好，行动敏捷，体质量增加，粪便软硬适中，肛周干净。模型组和假电针组大鼠食欲差，行动迟缓，体质量增长缓慢，易腹泻。电针组大鼠精神状态、饮食、活动能力均有不同程度改善，极少腹泻，肛周皮毛污秽减少，体质量较模型组和假电针组明显增加。

2.2 各组大鼠AWR评分 与正常组比较，模型组大鼠AWR评分明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，电针组大鼠AWR评分均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;假电针组大鼠AWR评分无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。与假电针组比较，电针组大鼠AWR评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.3 各组大鼠结肠病理形态学观察 各组大鼠结肠结构清晰，黏膜连续，腺体排列整齐、规则，无明显炎性细胞浸润，未见充血、水肿及溃疡，提示结肠组织无炎性反应、损伤等改变。见图2。

2.4 电针对IBS内脏痛大鼠血清β-EP、ENK水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清β-EP、ENK水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，电针组大鼠在经过治疗后血清β-EP、ENK水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;假电针组大鼠血清β-EP、ENK水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。与假电针组比较，电针组大鼠在电针治疗后血清β-EP、ENK水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.5 电针对IBS内脏痛大鼠下丘脑β-EP、ENK水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠下丘脑β-EP、ENK水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较，电针组大鼠在经过治疗后β-EP、ENK水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;假电针组大鼠β-EP、ENK水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。与假电针组比较，电针组大鼠在电针治疗后β-EP、ENK水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

根据IBS的临床表现，归属于中医“腹痛、泄泻”等疾病范畴，病因主要与外邪侵袭、饮食不节、情志内伤等有关，病位在肠，与肝脾胃肾等脏腑密切相关。现代医学对本病的病机尚不明确，临床治疗主要以缓解症状为主。早在《黄帝内经》里面就有针灸治疗腹痛、泄泻的记载，如《灵枢·邪气藏府病形》：“飧泄，大肠痛，巨虚上廉主之”。《针灸大全》：“腹中寒痛，泄泻不止，里急后重，天枢二穴”。上巨虚、天枢分别是大肠经的下合穴及募穴，合募配穴，增强疗效。现代临床和实验研究表明，采用天枢和上巨虚为主穴治疗IBS内脏痛疗效确切，并初步阐述了针灸治疗IBS内脏痛的机制[13-15]。

Aughes于1975年首次从猪脑内分离出具有阿片样活性的多肽，称之为内源性阿片肽（EOP），简称内阿片肽。EOP的发现极大地促进了人们对中枢和外周镇痛系统的研究。正常情况下，EOP处于静息状态，当机体受伤害性刺激时，脊髓背角第一神经元末梢释放递质，将痛觉传至第二神经元，激活EOP镇痛系统，释放EOP，实现对传入痛觉冲动的中枢性控制[16]。随着现代医学发展，对EOP镇痛系统的研究也逐渐加深。不断有研究证实，EOP镇痛系统参与多种疼痛的发声和发展过程。如贾旺华等[17]采用电针足三里、昆仑穴研究足底切口痛大鼠的镇痛作用机制，结果表明电针能有效提高足底切口痛大鼠的痛阈，其作用机制可能与提高大鼠下丘脑β-内啡肽水平有关。电针三阴交、血海能有效提高痛经大鼠的痛阈，其作用机制可能与提高大鼠下丘脑、血清β-内啡肽的水平密切相关[18]。电针对神经病理性疼痛大鼠的镇痛效应可能是通过提高大鼠下丘脑β-内啡肽和脑啡肽水平而发挥作用，表明β-内啡肽、脑啡肽参与疼痛发生和发展以及镇痛过程[19]。内源性阿片肽广泛参与疼痛的过程，其参与的病种随着研究深入逐步增加，目前基于国际较为公认的研究结论“针刺释放内源性阿片肽物质”为切入点，应用蛋白互作软件STRING，构建了针刺阿片肽及相关蛋白相互作用网络，预测针刺阿片肽系统的潜在治疗病症，进一步扩大了针刺对阿片肽系统的调控作用[20]。

本研究采用球囊刺激乳鼠直结肠制备IBS内脏痛大鼠模型，经造模后，模型组大鼠较正常组大鼠疼痛敏感度增加，主要表现为对结直肠扩张（AWR）刺激反应增强。经电针治疗后，電针组大鼠AWR评分明显下降，表明电针能有效提高IBS内脏痛大鼠的痛阈。对各组大鼠血清和下丘脑β-EP和ENK进行检测，电针组大鼠血清和下丘脑β-EP和ENK水平明显升高。

综上所述，电针对IBS内脏痛大鼠的镇痛机制之一可能通过促进外周和中枢镇痛物质（β-内啡肽、脑啡肽）的释放，激活EOP镇痛系统，从而达到缓解疼痛的作用。

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（2019-03-19收稿 责任编辑：杨觉雄）