近海沉积物与水体中天然大分子聚合物降解菌的原位富集与多样性分析

齐明明，李建洋，刘宪华，邵宗泽

(1.天津大学环境科学与工程学院，天津 300387； 2.自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋遗传资源重点实验室、福建省海洋遗传资源重点实验室，福建 厦门 361005)

海洋中存在各种来源的天然有机物，是一个巨大的碳库，在全球碳循环中起着决定性作用[1-2]。海洋中有机物的矿化是全球碳循环的一个中心过程，影响着全球海洋生态系统与全球气候的变化走势[3]，而各种微生物通过对有机物的分解代谢在这一过程中发挥着重要作用[4]。前人对海洋水体环境中由生物的碎片、粪球和细胞外多糖所聚集形成的悬浮颗粒物及其附着的异养细菌有较多研究[4]，然而对动植物组织及其大分子进入海洋环境中与微生物的相互作用研究不多。目前从海洋环境中分离得到的常见有机物降解菌多为好氧细菌，包括海杆菌属(Marinobacter)、盐单胞菌属(Halomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、产气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、芽孢杆菌属(Bacillus)、交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)等[5]，种类多样性较高。然而，有机物降解过程中消耗大量氧气造成有机物局部微环境缺氧，海洋沉积物等厌氧环境下有机物降解菌的多样性还有待进一步研究。

本实验通过选取不溶于水的代表性天然有机物，于近海沉积物与海水表层环境中进行降解菌原位富集。底物包括鱼鳞、虾壳、海带叶片、几丁质和壳聚糖，其中鱼鳞、虾壳和海带叶片是从海洋中有机体脱落下来的以生物高分子聚合物为主要成分的生物组织；而几丁质和壳聚糖是海洋甲壳类外骨骼的重要成分，在海洋中含量丰富，但较难降解。据报道，实验室分离得到的鱼鳞降解菌多为芽孢杆菌类，如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[6]、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)[7]等；海洋几丁质降解菌有粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、 环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、交替单胞菌属(Alteromonas)等[8]；海洋壳聚糖降解的细菌主要来源于芽孢杆菌属[9-11]、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属[12]、微杆菌属(Microbacterium)[13]，此外还有曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)[12]、青霉属(Penicillium)[14]等真菌；海带降解菌有芽孢杆菌属[15-16]、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)[17]等。

目前有机物的降解菌主要通过实验室好氧条件培养分离得到，而在海洋原位环境下，有哪些细菌真正参与了这些有机物的降解与矿化还不清楚。本研究结果将有助于我们认识难降解大分子天然有机物在近海环境下的微生物矿化过程，为分析有机物矿化与海洋碳循环提供参考。

1 材料与方法

1.1 近海原位培养

以鱼鳞、海带叶片、虾壳、几丁质和壳聚糖为有机底物，分别取1.5 g样品装入50 cm3离心管，用300目纱绢封口，高温120 ℃灭菌20 min后分别布放于厦门观音山潮间带(24.50°N，118.21°E)海水表层和沉积物两种环境中，将离心管分别固定在悬浮绳索或埋藏在沉积物表层下10 cm处，每组设置3个平行。原位富集30 d后，于2018年9月1日取回实验室，经过孔径为0.22 μm的聚碳酸酯膜(直径为47 mm)采用负压过滤的方法将微生物富集样品收集到滤膜上[18]。过滤完成之后迅速将滤膜于-80 ℃保存，30 d内完成 DNA 样品的提取。

1.2 富集菌群的基因组DNA提取和16S rRNA基因的高通量测序

将采集的滤膜样品剪碎研磨，按照DNA提取试剂盒(上海赛百胜基因技术有限公司)的步骤说明进行DNA提取。利用NanoDrop 2000核酸测定仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]测定样品DNA浓度。限于实验条件，选取每组平行样品中高浓度的DNA样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序，细菌引物为338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，进行双端测序。经过序列筛选后，从10个环境样本中共获得590 708条序列和326 100个分类操作单元(Operational Taxonomic Unit， OTU,通常对大于97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析)。统计结果显示，各样本序列数范围为43 660～72 433条，平均每个样本约59 071条序列。

1.3 数据分析与处理

为保证后续数据的准确性，对高通量测序得到的数据进行质控分析得到去掉 Barcode的Clean数据。利用USEARCH软件[19]对序列进行拼接去重复，将相似度大于97%的物种聚类为1个OTU。通过Greengene数据库对所得到的OTU进行分类比对，利用Mothur软件[20]对序列进行抽平计算α-多样性指数Sobs、Shannon、Simpson、Ace、Chao和Coverage。在不同分类学水平上对样品进行主成分分析，绘制相关性热图。

2 结果与讨论

2.1 天然有机物原位富集样品30 d后表观描述

样品原位富集30 d后，沉积物环境下离心管中充满黑色液体，有刺鼻的硫化氢气味；水上环境下离心管中液体浑浊，不同环境下底物均有剩余。

2.2 天然有机物原位富集降解菌群的细菌α-多样性分析

通过高通量测序，共获得两种环境5种有机底物的10个富集菌的16S rRNA基因测序数据，通过α-多样性分析获得多样性指数统计结果(表1)。可以看出，所有样品的序列Coverage值均在0.99以上，说明测序数据有效可靠。由表1中Sobs、Chao、Ace指数显示，两种环境下不同有机物原位富集的物种丰度和多样性存在明显的差异。水体环境富集样品的物种丰富度明显高于沉积物环境。推测相对于水体富集物，沉积物样品中各种有机物在第30天优势降解菌群得到更显著的富集。

表1 大于97%相似水平下不同样品的α-多样性指数Tab.1 α-diversity indexes at more than 97% similarity level in different samples

续表1

2.3 各种原位富集物的细菌群落组成

从OTU 聚类结果来看，本次实验共得到45个门，95个纲，214个目，360个科，598个属。其中占比较高的细菌门分别是：变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和热袍菌门。沉积物环境下海带叶片样品中占比最大的为热袍菌门，占总细菌的比例为50.87%，而在其他所有富集样品中，变形菌门占有绝对优势，占总细菌的比例分别为：①海水表层环境中，鱼鳞：57.49%、海带叶片：54.08%、壳聚糖：33.27%、几丁质：25.33%、虾壳：30.71%；②沉积物环境中，几丁质：70.69%、虾壳：38.44%、壳聚糖：35.38%、鱼鳞：32.51%、海带叶片：24.80%。沉积物海带叶片富集样品中的OTU数目仅为470，物种组成明显较低。

在纲水平上，各样品中细菌组成差异较大，如图1所示。在沉积物中，除海带叶片富集菌群中的优势菌群为热袍菌纲外，其他均为δ-变形菌纲。在海水中，海带叶片、鱼鳞富集菌的优势类群为γ-变形菌纲。拟杆菌纲在壳聚糖和虾壳样品中占比较大，而Modulifexia纲是几丁质富集样品的优势类群，占比达到18.70%，但在其他样品中占比均比较低。

图1 厦门近岸海水与沉积物中大分子聚合物原位富集过程中细菌在纲水平上的群落结构Fig.1 Community structure of bacteria at the class level during in situ enrichment of macromolecules in nearshore seawater and sediments of Xiamen水体：HDW表示海带叶片，JDZW表示几丁质，KJTW表示壳聚糖，XKW表示虾壳，YLW表示鱼鳞；沉积物：HDS表示海带叶片，JDZS表示几丁质，KJTS表示壳聚糖，XKS表示虾壳，YLS表示鱼鳞,下同。

2.4 不同有机物富集菌群群落间相似性分析

基于OTU水平构建物种相似树图(图2)，同一种有机物，海水表层与沉积物环境中富集菌群结构差异较大。不同底物样品，海水表层环境富集样品OTU组成虽然也有较大差异，但倾向于汇集一起。

图2 基于OTU的样品间聚类关系树Fig.2 Similarity tree based on OTU samples

几丁质和壳聚糖样品无论是海水表层还是沉积物环境中，相似性都最高。沉积物环境中它们以δ-变形菌纲为优势菌纲(>20%)，在海水表层环境中，γ-变形菌纲为优势菌纲(>20%)，沉积物中海带叶片样品与其他样品差别较大。

在属水平构建相似性热图(图3)，其中色块颜色梯度来展示样本中不同物种的占比变化情况。总体上看，在所有样品中脱硫杆菌属(Desulfobacter)是优势菌属；而弧菌属在沉积物样品壳聚糖和几丁质中占比较高，其中几丁质样品中占比高达26.21%，表明其参与了几丁质降解。比较不同环境下几丁质样品在属水平上群落组成发现，沉积物环境下弧菌含量明显高于海水表层环境，推测沉积物环境下的条件更有利于弧菌的活性。在目前研究中，莫照兰等(2000)在虾池中筛选出了高效降解菌Vibriospp.[21]，肖湘等(2003)分离得到了几丁质高效降解弧菌Vibriosp.11211[22]，暗示了弧菌菌株可能高效地降解几丁质同时研究发现弧菌可以产生几丁质酶降解几丁质，获得生长所需碳源和氮源[23]。本研究通过近海原位培养，证明弧菌在自然海洋环境中是几丁质的重要分解者。

2.5 不同环境下细菌群落差异性分析

在科水平上，采用“Wilcoxon秩和检验”双尾检验方法，比较两种环境下，全部样品的菌落差异，如图4所示，不同环境下种群分布和占比存在较大差异，其中在脱硫弧菌科、黄杆菌科、弧菌科和红细菌科存在显著差异(0.01

图4 不同环境组间群落科水平上占比显著性差异检验Fig.4 Tests for significant differences in compositions between different environmental groups at the family level“*”表示0.01

为了进一步比较不同环境下样品群落结构组成，选择几丁质样品，比较其在不同环境下科水平上菌落组成差异，结果如图5所示。得到不同环境下，群落组成和占比存在极显著差异(p<0.001)。

图5 不同环境下几丁质样品科水平上菌群比较 Fig.5 Comparison of microbial communities in chitin samples from different habitats at the family level“***”表示p<0.001，样品中菌群差异性极显著；图中绿色代表沉积物环境下的几丁质样品，红色代表海水表层环境下的几丁质样品。

2.6 讨论

海洋细菌在海洋生态系统中占据重要的地位[24]，在海洋微食物网、有机物矿化与元素生物地球化学循环过程中发挥着重要作用。本研究通过利用不同天然有机物在近海环境中原位富集、高通量DNA测序，认识近海原位环境下海洋来源的高聚物降解菌多样性。结果发现，无论是海水表层还是沉积物环境富集物中，厌氧降解菌与好氧降解菌并存。从多样性上看，海水表层富集物高于沉积物。在海水表层环境富集样品中，黄杆菌科细菌占比较大，而沉积物样品中脱硫杆菌科细菌为优势种。样品在沉积物中埋藏7 d后，颜色明显变黑，产生浓厚的硫化氢气体，表明各种有机物厌氧降解过程耦合着硫酸盐还原；而在海水表层，推测初期的好氧环境，随着降解过程推进，也会导致样品内部缺氧。黄杆菌是拟杆菌门中最大的科，多为好氧，少量是微好氧与厌氧[25]。其中Kaoutari等(2013)在动物肠道菌群中发现，部分拟杆菌门细菌编码较多糖苷水解酶和多糖裂解酶的基因，暗示该类微生物参与了多糖类有机物的降解[26]，陈三凤等(1993)发现了1株可降解几丁质的黄杆菌B1[27]。脱硫杆菌菌株为严格厌氧，可以将有机物氧化成CO2，本研究中在沉积物富集样品中，脱硫杆菌菌株作为优势菌之一，推测它们参与了有机物的降解。在沉积物富集中的虾壳和鱼鳞富集样品，梭菌科占有绝对优势，其次为脱硫杆菌科。梭菌科为发酵型专性厌氧革兰氏阴性杆菌，可以发酵有机物，产生各种有机酸，如乙酸、丙酸、丁酸、甲酸或琥珀酸[28]。鱼鳞和虾壳被梭菌科细菌降解发酵后，产生的有机酸可能为脱硫杆菌提供电子供体，也可能脱硫杆菌直接参与了虾壳和鱼鳞的厌氧降解。

本实验通过对不同天然大分子有机聚合物原位富集30 d，得到不同有机物菌群组成和占比差异明显，例如几丁质样品在沉积物和海水表层环境下占比最大的分别为弧菌科；沉积物环境下，脱硫弧菌科在不同样品中占比较大，推测可能在原位富集有机物降解中发挥较大的作用，但所占的比例差异明显。同时结合现有研究报道[26-28]，原位条件下参与有机物降解的细菌与实验室得到结果也存在一定差异。

3 结论

为研究在原位环境下参与有机物降解的菌群种类，本实验选取虾壳、鱼鳞、海带叶片、几丁质和壳聚糖作为有机底物，分别在海水表层和沉积物中进行富集，定期取样，通过高通量测序分析菌群多样性。得出不同富集环境下不同底物菌群结构、物种多样性存在较大差异，本研究分析结果可为研究有机物的矿化提供一定的理论依据。