复方中药及其与抗生素联用对斜带石斑鱼变形假单胞菌病的防治效果

徐晓津，李秀华，马一帆，李慧耀，祁 欣，吕海龙，鄢庆枇

(1.集美大学水产学院，福建 厦门361021； 2.福建天马科技股份集团有限公司，福建 福州 350308；3.厦门医学院附属第二医院中医科，福建 厦门361021； 4.厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门 361005)

斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)肉质鲜美，营养丰富，是我国海水鱼类养殖的重要经济鱼类。福建省石斑鱼产业链产值超50亿元，是福建省推进水产千亿产业链建设的11个品种之一，是海南、广东、福建等地重要的工厂化养殖鱼类[1]。多年来，养殖户不断提高养殖密度，多地已多次爆发石斑鱼细菌性疾病，造成严重的经济损失。据不完全统计，2012年天津斜带石斑鱼溃烂病爆发，造成的经济损失约为500万元[2]。研究表明用变形假单胞菌(Pseudomonasglecoglossicida)人工感染斜带石斑鱼，病鱼死亡率达100%，病鱼脾脏出现大量白点[3-4]。抗生素已被较广泛地用于鱼类细菌病防治，但病原菌易产生耐药性，且病鱼机体有抗生素等药物残留。而中药则含有多种免疫活性物质，并有抑菌及灭菌作用[5-6]，无药物残留问题。因此复方中药或中西药联用已被广泛用于鱼病治疗。研究发现在饲料中添加板蓝根、黄芪和茯苓等能治疗南美白对虾(Litopenaeusvannamei)疾病[7-9]。复方中药已被用于治疗刺参(Apostichopusjaponicus)、金丝鱼(Tanichthrsaltbonubes)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、日本鳗鲡(Anguillajaponica)的疾病[8, 10-14]。但尚未有学者进行复方中药治疗鱼类变形假单胞菌病的研究，也未有中药治疗石斑鱼变形假单胞菌病的报道。

本研究前期开展中药及抗生素抑制变形假单胞菌研究，筛选出抑菌作用极强的三联复方中药黄连、黄芪、黄柏，在60 mg/mL 浓度下，其对变形假单胞菌的抑菌圈为21.95±1.48 mm，恩诺沙星的抑制细菌效果为敏感，抑菌圈直径为22.55±1.82 mm[15]。本研究将筛选出的敏感药物黄连、黄芪、黄柏及恩诺沙星添加至饲料中，治疗石斑鱼变形假单胞菌病，比较不同质量比例的复方中药及中西药联用治疗斜带石斑鱼细菌性疾病的效果，为水产养殖病害防治提供参考。

1 材料及方法

1.1 菌种

本研究所用变形假单胞菌分离于患病石斑鱼，保存于集美大学水产学院病害实验室[16]。采用LB 液体培养基培养8～12 h，调整细菌OD600值为0.5，保存于-4 ℃冰箱。再用LB 液体培养基培养细菌，采用麦氏计数法调整变形假单胞菌浓度至1×107cfu/mL。

1.2 筛选及制备复方三联中药

采用前期筛选的中药黄连、黄芪、黄柏制备不同的复方中药配方。复方中药配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中黄连、黄芪、黄柏的质量比分别为：0.9∶1.3∶0.9、1.2∶0.9∶1.0、1.0∶1.0∶1.0。中药颗粒由江阴天江药业有限公司生产，通过炮制中药药材、浓缩药液并制备颗粒，制备成与生药药性相同且可溶于水的颗粒剂。用无菌蒸馏水溶解中药颗粒，隔水加热30 min至中药颗粒溶解，制备相当于生药材质量浓度为60、70、80 mg/mL的药液[17]。

1.3 复方三联中药抑菌活性测定

用改良牛津杯法进行复方中药抑制变形假单胞菌实验[17]，用移液枪吸取0.1 mL浓度为 1×108cfu/mL的菌悬液，滴在固体培养基上，涂匀。在1个孔中加入200 μL的无菌水作为对照，在另3个孔中分别加入200 μL含60、70、80 mg/mL生药不同复方三联中药液，于28℃下培养18～24 h，用SupcreG1抑菌圈测量仪测量各组的抑菌圈大小[17]。中药抑菌能力的判定标准为:抑菌直径≥ 20 mm为极敏感“+ + +”，15 mm≤抑菌直径<20 mm为高敏“+ +” ， 10 mm≤抑菌直径< 15 mm及抑菌直径< 10 mm分别为中敏、低敏或称为无效“-”[17]。

1.4 三联中药及中西药拌饵投喂治疗鱼变形假单胞菌病研究

黄连、黄芪与黄柏购于厦门莲福堂药店，采用购自天津市泰斯特仪器有限公司的中药粉碎机 (FW177)，将各药材粉碎为约150 μm大小，将粉末用山东三清不锈钢设备有限公司生产的超微粉碎机(三清振动微粉机，SQW-60)再次粉碎至约5～10 μm大小的超微药粉[17]。抗生素恩诺沙星购于兴化市恒威生物技术有限公司。石斑鱼饲料由福建天马科技股份集团有限公司提供。在饲料中添加黄连、黄芪与黄柏复方中药或复方中药与恩诺沙星联用做为实验组，以基础饲料投喂组为对照。烘干黄连、黄芪与黄柏中药超微药粉，按等质量混匀，用 160目筛绢过滤，三联中药质量分数为基础饲料的2.2%。用SLX-80型饲料挤压机，制作成1.0 mm的颗粒饲料，烘干(60 ℃，12 h)、装袋并密封备用[17]。

通过预实验，采用攻毒后80%斜带石斑鱼有变形假单胞菌病的症状，且无病鱼死亡的攻毒细菌浓度(1×102cfu/g)为本研究的攻毒细菌浓度。斜带石斑鱼体长为(12±2) cm，体重为(21±3) g，购于福建省宁德市养殖场。设实验组和对照组，每组各20 尾鱼，于18 ℃的1 t循环水养殖系统内暂养斜带石斑鱼1周。采过胸腔注射的方式对受试鱼进行攻毒，变形假单胞菌的浓度为1×102cfu/g。对照组鱼注射PBS缓冲液。阴性照组Ⅰ为健康鱼且仅投喂饲料、阳性对照组Ⅱ为感染细菌的病鱼组且仅投喂饲料。

以下各组均进行变形假单胞菌攻毒斜带石斑鱼实验。其中三联复方中药实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ投喂的饲料中添加黄连∶黄芪∶黄柏的质量比为0.9∶1.3∶0.9、1.2∶0.9∶1.0、1.0∶1.0∶1.0。实验组Ⅳ、V、VI为中西药联用复方组，在投喂的饲料中添加三联复方中药及恩诺沙星，黄连∶黄芪∶黄柏∶恩诺沙星的质量比例为 0.9∶1.3∶0.9∶1.3、1.2∶0.9∶1.0∶0.9、1.0∶1.0∶1.0∶1.0。同时进行三联复方中药与生产常用药物板黄散及大黄五倍子散的药效对比研究，添加的板黄散及大黄五倍子散占饲料质量比为2.2%，添加板黄散的为对照组Ⅲ；添加大黄五倍子散的为对照组Ⅳ，均进行3次重复。每天于8:00、17:00投喂2次，按斜带石斑鱼鱼体质量的2%～3%作为投饲量，每日吸出残余饵料并换水。

每天检查患病石斑鱼症状与死亡率，统计病鱼累积死亡率(Rate of Cumulative Mortality,RCM) 。

RCM(%)= [(N0-Nt)/N0]×100

(1)

式(1)中:RCM是累积死亡率(%) ，N0指开始实验石斑鱼的总数，Nt为结束实验时石斑鱼的总数。各实验组鱼死亡率为100%时结束实验，统计各组石斑鱼死亡率。

1.5 数据统计

用SPSS 24.0软件进行数据的统计，包括单因素方差 (ANOVA)分析，通过Duncan’s多重比较法进行各数据的差异显著性(p<0.05)分析，数据以平均值±标准差(X±SD) 表示。

2 结果与讨论

2.1 复方三联中药体外抑制变形假单胞菌的比较

由表1可知，复方中药配方I、II、III组随着药物浓度的增大，药物抑制细菌的效果也增强。药物浓度为60 mg/mL，黄连、黄芪、黄柏质量比为1.2∶0.9∶1.0的复方中药配方Ⅱ为最佳配方(表1)，是具有用药少且抑制细菌效果强的药物配方。

表1 复方中药配方I、 II、III制备的不同浓度中草药溶液的抑菌情况Tab.1 Bacteriostatic effect of different concentrations of Chinese herbal formulas I, II and III on Pseudomonas plecoglossicida in vitro

2.2 复方中药和中西药联用治疗斜带石斑鱼变形假单胞菌病的效果分析

注射变形假单胞菌2 d后，各实验组、对照组Ⅳ及对照组Ⅲ鱼饲料残留增加，斜带石斑鱼减少摄食饲料。5 d后，各组感染细菌的斜带石斑鱼有死亡现象，病鱼腹部膨大，脾脏出血、有白点，解剖发现病鱼肠内食物少，少量无症状且死亡。各组鱼的死亡情况见表2。

表2 投喂复方中药与中西药联用效果比较Tab.2 Comparison of survivals among groups fed with Chinese herbal formula along and Chinese and Western medicine combination formula

各组鱼感染变形假单胞菌40 d 后，病鱼的死亡数有明显差别(图1)，不同实验组与对照组斜带石斑鱼的死亡率由高到低为：对照组Ⅱ>对照组Ⅳ>对照组Ⅲ>实验组Ⅰ>实验组Ⅲ>实验组Ⅱ>实验组V>实验组VI>实验组Ⅳ>对照组Ⅰ。

图1 投喂复方中药药饵后不同时间段实验组与对照组鱼死亡情况Fig.1 Mortalities of fish fed with Chinese herbal formula bait in experimental and control groups with times

对照组Ⅰ的健康鱼未出现死亡或病症，摄食正常。对照组Ⅱ攻毒3 d后开始出现1尾鱼死亡，病鱼死亡高峰期在第17天，死亡率为100%。

复方中药投喂组：感染变形假单胞菌8～10 d后，实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均出现2尾鱼死亡，病鱼死亡数量多出现在43～45 d， 至58～73 d病鱼死亡率为100%。攻毒40 d后，实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的病鱼死亡率分别为(38.7±1.2)%、(31.7±0.6)%、(34.3±0.6)%。实验组Ⅱ在对病鱼所投喂的饲料中添加质量比例为1.2∶0.9∶1.0的黄连∶黄芪∶黄柏，其治疗鱼病效果最好。

中西药联用投喂组：感染变形假单胞菌15～21 d后，实验组V、VI、Ⅳ中组均有1尾鱼死亡，在45～55 d病鱼死亡数量大。在攻毒60～73 d后，各组病鱼死亡率为100%。中西药联用实验组Ⅳ、V、VI，40 d鱼死亡率为(16.7±1.5)%、(21.0±1.0)%、(19.3±1.2)%。实验组Ⅳ在对病鱼投喂的饲料中添加质量比例为0.9∶1.3∶0.9∶1.3的黄连∶黄芪∶黄柏∶恩诺沙星，治疗斜带石斑鱼变形假单胞菌病效果最好。对照组Ⅲ与对照组Ⅳ中的板黄散与大黄五倍子散为养殖场常用药物，攻毒40 d后，对照组Ⅲ、Ⅳ病鱼的死亡率为(83.3±1.5)%、(93.7±1.5)%，板黄散与大黄五倍子散治疗组的病鱼死亡率高于复方中药与中西药联用投喂组。结果表明各配方药物均比生产常用药物板黄散、大黄五倍子散的疗效强，中西药联用配方比复方中药组药物疗效好。

2.3 讨论

变形假单胞菌能引起石斑鱼内脏白点病[18]，造成严重的经济损失。在水产养殖中长期使用抗生素治疗鱼病，病原菌易产生耐药性。而中药具有副作用小、无药物残留、价格低、疗效好等优点，同时能提高鱼类免疫力。中药能抑制或杀灭细菌，已被长期用于养殖场鱼病防治。研究表明枸杞(Lyciumbarbarum)、香菇多糖及黄芪对金丝鱼(Tanichthysaltbonubes)的用药安全浓度分别为156.81、278.92、239.49 mg/L，是安全、低毒性的饲料添加剂[12]，在鱼病防治工作中已取得较好的疗效。尽管中药已被广泛地应用于水产养殖病害防治，并取得较好的疗效[7]，但不少中药抑制及杀灭细菌的机理未明了，不同中药对细菌的抑制作用也不同，不同中药对不同鱼类细菌性疾病的治疗效果不同。因此，通过不同药物进行鱼类病害治疗的实验加以比较、验证，才能筛选出有效的复方中药及中西药联用药物。本研究通过采用不同质量比的黄连、黄芪、黄柏进行抑菌实验，通过不同质量比的复方中药、中西药联用药物进行斜带石斑变形假单胞菌病的治疗效果比较研究，筛选治疗鱼病效果好的复方。黄连、黄芪、黄柏、恩诺沙星组成的中西药联用药物比中草药复方疗效强；不同质量比的复方中药及中西药联用药物对斜带石斑变形假单胞菌病的疗效均强于生产常用药板黄散、大黄五倍子散。这与其他学者的研究结果相似[19]。

不少学者采用中药进行鱼病防治，结果显示复方中药疗效好，可提高草鱼(Ctenopharyngodonidellus)免疫力、抗病力[19]。复方中药已被用于治疗日本鳗鲡、锯缘青蟹(Scyllaserrata)疾病[20-21]。金银花、山楂、黄芪和党参可增强刺参抗病力[22-23]。葛根、黄连、金银花、板蓝根和黄芪等复方中药能降低凡纳滨对虾白斑综合征病毒(WSSV)病的死亡率[24]。茵陈三黄汤为主的药物能减少鲑鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)肝损伤，降低病鱼死亡率，有效防治细菌性疾病[11]。具有协同作用的复方中药(黄芪、板蓝根、金银花和生石膏) 与黄芪对鱼的免疫保护率分别为79.19%、46.00%[19]，说明复方中药的药效高于单方中药。多联中药已被用于治疗草鱼细菌性疾病，研究表明投喂周期为14～21 d能增加病鱼免疫力、抗病力[19]。

抗生素恩诺沙星对鱼类细菌性疾病的治疗效果好，在饲料中添加恩诺沙星，其在大福瑞鲤(Cyprinuscarpio)肌肉、肝胰脏、肾脏中的浓度均先升后降[25]。但如果使用抗生素，在16、25 ℃等不同温度、10、20 mg/kg等不同给药剂量和肌注、口灌等不同给药方式条件下，在锯缘青蟹血淋巴中均能检出恩诺沙星，含量较低[26]。在集约化、规模化的水产养殖中，饲料中添加多联中药或中西药联用药物，能减少抗生素的使用，降低细菌耐药性，减少鱼体残留抗生素超标等问题，达到无公害水产养殖病害防治准则。

3 结论

本研究采用不同质量比例的黄连、黄芪、黄柏进行抑制变形假单胞菌实验，随着复方中药浓度的增加，药效也不断增强。药物浓度为60 mg/mL，黄连、黄芪、黄柏质量比为1.2∶0.9∶1.0为最佳抑菌配方，药物用量少且抑菌效果较强。

同时设置由不同质量比例的黄连、黄芪、黄柏组成的复方中药组，及不同质量比例的三种中药与恩诺沙星组成的中西药联用药物组，展开治疗斜带石斑鱼变形假单胞菌病的研究。结果表明复方中药组中实验组Ⅱ(在饲料中添加的黄连、黄芪、黄柏质量比例为1.2∶0.9∶1.0)对斜带石斑变形假单胞菌病的治疗效果最好。中西药联用组中实验组Ⅳ的药效最好，其黄连、黄芪、黄柏与恩诺沙星质量比例为0.9∶1.3∶0.9∶1.3。本研究各配方药物能较好地治疗石斑鱼变形假单胞菌病，采用的不同比例的黄连、黄芪、黄柏组成的药物配方均比生产常用药物板黄散、大黄五倍子散治疗鱼病的效果好。且中西药联用配方较复方中药组药物的治疗效果更佳。