紫叶小檗果小檗碱的提取及抑菌活性研究

谭 婷,朱 斌,杨 倩,吴娟娟,史 娟(陕西理工大学化学与环境科学学院,陕西省催化重点实验室,陕西汉中 723000)

抗生素类化合物可有效杀灭细菌、预防感染,在医药、畜牧业和水产养殖业中被大量使用。但因机体吸收不彻底,人或动物所服用的抗生素的30%～90%以代谢物或原态进入环境,导致抗生素污染较为严重[1-3]。近年来,“超级细菌”被频频报道,正是由于抗生素滥用产生的多重耐药菌株所致,全球每年约有70万人死于此类感染[3-6],目前出现的多重耐药菌株主要有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等[7]。来源于植物的生物碱、黄酮、萜、单宁、植物精油、多糖等物质皆具抑菌功能,这些抑菌成分对环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗性;同时,还具有促进作物生长、提高抗病性等作用,且种类多、开发途径广[8]。葛根芩连汤为中医经典配方,出自于《伤寒论》。徐蓓蕾等[9]研究表明葛根芩连汤具有较强的抗菌作用,而葛根芩连汤中重要组分黄连主要有效物质为小檗碱,即考虑将葛根与紫叶小檗果配伍,研究配伍抑菌剂对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的抑制作用。

我国幅员辽阔,地理复杂多变,植物资源丰富,为植物源抑菌剂开发利用提供了得天独厚的条件。小檗碱,又名黄连素,广泛存在于小檗科植物中[10],对细菌、真菌和原虫等病原微生物具有较强抑制作用,可用于多种疾病的治疗[11-13]。研究发现,小檗碱还具有消除细菌耐药质粒,恢复细菌对其他抑菌药物的敏感性的优点,可作为抗生素的潜在替代物[14-15]。稀硫酸法、乙醇浸提法、水提法常被用于植物中小檗碱的提取,但溶剂耗量大、提取耗时长、且得率低。超声波法和微波法具有省时、穿透力强、溶剂用量少的优点,但易导致有效成分结构遭到破坏[16-17]。生物酶法通过酶的预处理,增加了植物细胞壁通透性,诱导传质现象,有效促进生物活性化合物的释放,具有省时、高效、低能耗的优点[18];不足之处在于酶法受温度限制较大,植物有效成分仅靠低温酶浸提难以达到较佳的提取效果。

紫叶小檗(Berberisthunbergiivar.atropurpureaChenault)为小檗科(Berberis)落叶灌木,原产于东北南部至秦岭一带[19-20],在我国各大城市均有栽培,主要作为一种独特的园林观赏植物。目前对其药用价值的研究,主要集中在该植物的根或茎皮部位。向前胜等[21]的研究发现,紫叶小檗根茎部分小檗碱含量最高可达到3.49%。为进一步开发紫叶小檗植株的利用价值,提高经济效益,本实验以紫叶小檗果为研究对象,纤维素酶预处理后,水浸法对紫叶小檗果小檗碱进行提取,单因素及正交设计法确定紫叶小檗果小檗碱的最佳提取工艺,柱色谱法对所得小檗碱进行分离纯化。同时,研究小檗碱对六种植物病菌的抑菌作用;同时在《葛根芩连汤》的基础上将紫叶小檗碱与葛根进行配伍,进一步探究配伍抑菌剂对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制作用,为耐药抗菌制剂的配制提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫叶小檗果 沐阳县康卓园林有限公司;葛根 汉中市药材公司;马铃薯干腐病菌(Fusariumsolani,F.s.)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea,B.c.)、尖孢镰刀病菌(Fusariumoxysporum,F.o.)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides,C.g.)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea,M.g.)、苹果腐烂病菌(Cytosporasp,C.s.) 陕西理工大学生物科学与工程学院微生物实验室提供,在2～8 ℃冷藏保存,28 ℃条件下,在马铃薯培养基上培养;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli) 来自陕西理工大学生物科学与工程学院微生物实验室,于2～8 ℃冷藏保存,37 ℃条件下,在LB培养基上培养；盐酸小檗碱标品 纯度≥98%,西安开来生物工程有限公司;纤维素酶 5000 U/g,生物试剂,宁夏和氏璧生物技术有限公司;葡萄糖 分析纯,上海埃彼化学试剂有限公司;琼脂、酵母浸粉、胰蛋白胨 分析纯,北京市奥博星生物技术有限责任公司;无水乙醇 分析纯,天津市天利化学试剂有限公司;其他试剂 均为国产分析纯;实验用水 均为蒸馏水。

AR 124CN型电子天平 奥豪斯仪器上海有限公司;RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;恒温水浴锅 上海腾方公司;LD4-2A(Ⅱ)离心机 北京京力公司;DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;UV-2600型紫外分光光度计 日本津岛公司;SW-CJ-IB型超净工作台 苏州净化设备有限公司;SHP-80型生化培养箱 上海森德实验仪器有限公司;LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌箱 上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基制备 马铃薯固体培养基:取200 g去皮土豆,切成小块,加入1000 mL水,煮沸30 min,双层纱布过滤取滤液。加入20 g琼脂粉,20 g葡萄糖,并定容至1000 mL。加热搅拌均匀,将滤液放入压力蒸汽灭菌箱120 ℃高压灭菌30 min。胰蛋白胨固体培养基:取1000 mL水,加入10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸粉、10 g氯化钠、20 g琼脂粉,煮沸,放入压力蒸汽灭菌箱120 ℃高压灭菌30 min。

1.2.2 紫叶小檗果小檗碱的提取 紫叶小檗果洗净,研碎,烘至恒重后,精密称取4.00 g,加入1 μL,pH=1的稀硫酸溶液与20 mL水组成的混合溶液,加入一定量的纤维素酶,50 ℃恒温酶解一定时间后,加入一定体积的水做提取溶剂,浸泡提取一定时间后,200目过滤,常温3000 r/min离心10 min,弃去沉淀,收集上清液,得到紫叶小檗果小檗碱提取液。

1.2.3 单因素实验 采用“1.2.2”实验步骤,在固定其他工艺参数条件下,依次改变纤维素酶用量、酶解时间、料液比及浸提时间,分别考察四个因素的不同水平值对小檗碱得率的影响。每4 g紫叶小檗果纤维素酶用量考察水平分别为:20、40、80、120、160 mg,固定酶解时间120 min,料液比1∶10 g/mL,浸提时间60 min。酶解时间考察水平的工艺参数:酶解时间60、90、120、150、180 min,纤维素酶用量120 mg,料液比1∶10 g/mL,浸提时间60 min。料液比考察水平为:料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 g/mL,纤维素酶用量为120 mg,酶解时间为120 min,浸提时间60 min。浸提时间分别为:60、90、120、150、180 min,纤维素酶用量120 mg,酶解时间120 min,料液比固定1∶10 g/mL。各水平条件下分别计算小檗碱得率。

1.2.4 正交实验 根据单因素实验结果,选取纤维素酶用量(A)、酶解时间(B)、料液比(C)、水浸提时间(D)四因素,进行表1所示L9(34)正交实验,考察各因素水平条件下小檗碱得率。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 紫叶小檗果小檗碱的测定

1.2.5.1 标准品工作曲线的测定 参考文献方法[22-23],准确称取盐酸小檗碱标准品0.0052 g,使用无水乙醇将其溶解后,于100 mL容量瓶内定容,得到浓度为50 μg/mL的标准品储备液。准确吸取该储备液2、4、6、8、10 mL分别置于50 mL容量瓶中,以无水乙醇为溶剂定容,制得等浓度梯度的盐酸小檗碱溶液组。以无水乙醇为空白对照,在345 nm处测其吸光度。再以盐酸小檗碱浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得标准品工作曲线方程:A=49.479C+0.0048(R2=0.9998)。式中A为吸光度;C为盐酸小檗碱浓度,μg/mL。

1.2.5.2 小檗果小檗碱得率计算 吸取1 mL提取液,在345 nm波长下测定吸光值,每个样品平行做3组,取平均值代入工作曲线方程计算得到紫叶小檗果提取液中小檗碱的浓度,采用式(1)计算紫叶小檗果小檗碱的得率。

Y(%)=(C测×V/m)×n×10-6

式(1)

式中：Y为小檗碱得率,%;C测为工作曲线方程计算所得到小檗碱的浓度,μg/mL;V为定容体积,mL;m为称样量,g;n为稀释倍数。

1.2.6 色谱柱法纯化工艺 将最优条件下得到的紫叶小檗果水提取物在旋转蒸发仪中65 ℃减压旋转蒸发浓缩为棕褐色粘稠状后,加入少量中性氧化铝粉末拌均匀[21-22]。选用20 mm×700 mm色谱柱,在色谱柱下端塞入适量棉花并干法装柱。上样,室温进行中性氧化铝柱层析。以氯仿-甲醇梯度洗脱,调整流速为3 mL/min,每25 mL收集一份并依次编号。以“1.2.5.1”盐酸小檗碱贮备液做对照品,氯仿∶甲醇∶氨体积比15∶4∶1为层析液,进行薄层色谱分析[24-26],在紫外分析仪下进行洗脱液物质鉴定。合并与盐酸小檗碱贮备液组成相同的流分,旋转蒸干溶液得到紫叶小檗果实有效成分小檗碱的纯品。

1.2.7 抑菌实验 进行小檗碱对马铃薯干腐病菌(F.s.)、番茄灰霉病菌(B.c.)、尖孢镰刀病菌(F.o.)、苹果炭疽病菌(C.g.)、水稻稻瘟病菌(M.g.)和苹果腐烂病菌(C.s.)六种植物病菌抑菌活性测定以及配伍抑菌剂对两种细菌的抑菌活性测定。

1.2.7.1 小檗碱对植物病菌抑菌活性测定 将“1.2.6”所得小檗碱配制为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的梯度带小檗碱的马铃薯固体培养基,并设置小檗碱浓度为0 mg/mL的空白对照组。取活化后的F.s、B.c.、F.o.、C.g.、M.g.和C.s.六种植物病菌,使用打孔器制得直径为7 mm的病菌菌饼,将菌饼的菌丝面向下呈“品”字形放置于凝固的抑菌培养基中,以菌饼互不干扰生长为准。恒温28 ℃培养72 h,以十字交叉法测定抑菌圈直径大小,每组实验重复三次,并由如下公式计算得到抑菌率。

抑菌率计算公式为:

抑菌率(%)=(空白组平板菌落直径-样品组平板菌落直径)/(空白组平板菌落直径-7 nm)×100

1.2.7.2 小檗果及与葛根配伍组分对细菌抑菌活性测定 抑菌剂的制备:参照文献[27]进行实验方案设计,设置葛根与紫叶小檗质量比分别为0∶50、6∶44、12.5∶37.5、25∶25、50∶0。按质量比各准确称取小檗果与葛根生药每份50 g,共五份,分别加入20倍量水,浸泡30 min,水煎煮2次,每次120 min,第二次煎煮加入10倍水,合并2次滤液,旋蒸至棕褐色糊状浓稠液,然后装进密封袋,放入冰箱中保存备用。

参照文献[27-28]方法,使用打孔器制得直径6 mm圆形滤纸,高压灭菌后,向各滤纸片中滴加20 μL小檗果与葛根配伍所制得的抑菌剂药液,室温晾干。分别将107CFU/mL金黄色葡萄球菌或大肠杆菌悬液均匀平铺于各胰蛋白胨固体培养基中,吸出多余菌液重复利用。将含同种药液滤纸片呈“品”字形放置三片于含菌培养基中,恒温37 ℃培养24 h测定抑菌圈直径。每个菌种重复实验三次,以无药液圆形滤纸片为对照组,所得抑菌圈直径均为三次实验平均值。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 纤维素酶用量对小檗碱得率的影响 由图1可知,紫叶小檗果小檗碱得率随纤维素酶用量增加,呈升高趋势。在纤维素酶用量为20～40 mg时,小檗碱得率迅速升高;在40～80 mg时小檗碱得率增幅减缓;超过80 mg继续增加纤维素酶用量对小檗碱得率影响较小。这是因为实验限定的紫叶小檗果投量有限,在纤维素酶用量为80 mg时,大部分小檗碱已成功析出,故而继续增加纤维素酶用量对得率影响较小,综合得率与成本,确定纤维素酶用量以80 mg为宜。

图1 纤维素酶用量对小檗碱得率的影响Fig.1 The effect of cellulose on berberine extraction rate

2.1.2 酶解时间对小檗碱得率的影响 由图2可知,小檗碱得率在酶解时间为60～150 min时呈明显上升趋势,而在150～180 min范围内呈下降趋势,出现此趋势的原因可能为:增加酶解时间有利于纤维素酶分解紫叶小檗果实,随着时间的增长,果实细胞壁逐渐疏松,小檗碱更易从细胞内部进入溶液,从而提高了小檗碱得率使小檗碱得率(达到0.19%)。而酶解时间过长导致小檗碱得率由0.19%下降至0.18%,可能是因为细胞壁过于疏松,从而更多杂质进入提取液中影响小檗碱的检测[29],故选择150 min作为最佳酶解时间。

图2 酶解时间对小檗碱得率的影响Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis time on berberine extraction rate

2.1.3 料液比对小檗碱得率的影响 由图3可知,料液比在1∶8～1∶12 g/mL时,得率随着料液比的降低而逐渐升高,说明增加提取溶剂用量,有利于小檗碱的溶出,故而得率升高。在料液比为1∶12 g/mL时达到峰值。当料液比小于1∶12 g/mL之后,小檗碱得率增加较为缓慢。但继续增加溶剂用量,小檗碱得率出现小幅降低。这可能是因为,底物有限,料液比过小导致水溶性杂质增多,干扰了小檗碱的测定。故选择最佳提取料液比为1∶12 g/mL。

图3 料液比对小檗碱得率的影响Fig.3 The effect of material to liquid ratio on berberine extraction rate

2.1.4 浸提时间对小檗碱得率的影响 由图4可知,在60～150 min提取时间范围内,随着时间的增长,小檗碱得率增加。在60～90 min范围内小檗碱得率增加较快;当时间范围为90～150 min时小檗碱得率缓慢增加。可能原因为:紫叶小檗果中小檗碱按一定速率扩散进入溶液中,在60～90 min时间段内,细胞内外小檗碱渗透压较大导致小檗碱在此段时间中快速渗透至溶液中使小檗碱得率在此阶段迅速上升,在浸提时间为90 min时小檗碱得率达到0.186%;之后因小檗碱已基本扩散完全,导致90～150 min时小檗碱得率增加缓慢。同时,过长的浸提时间可能会造成小檗碱结构发生改变,使得在150～180 min阶段小檗碱得率由0.187%下降至0.180%[29-30]。选择最佳浸提时间为150 min。

图4 浸提时间对小檗碱得率的影响Fig.4 The effect of extraction time on berberine extraction rate

2.2 正交实验

2.2.1 正交实验 由表2可知,四个因素对小檗碱得率的影响大小为:D>A>B>C,即浸提时间>纤维素酶用量>酶解时间>料液比。根据正交实验结果进行直观分析和考虑综合因素,紫叶小檗果小檗碱的最佳的提取条件是A3B1C2D2,即纤维素酶用量120 mg,酶解时间120 min,料液比1∶12 g/mL,水浸提时间150 min。

表2 正交实验及极差分析Table 2 Orthogonal experiment and rang analysis

2.2.2 验证性实验 为进一步考察上述优选工艺的稳定性,按正交实验最佳条件:纤维素酶用量120 mg、酶解时间120 min、料液比1∶12 g/mL、提取时间150 min,进行三次平行实验。计算小檗碱得率,得到平均得率为0.198%±0.0066%。

2.3 抑菌实验结果

2.3.1 小檗碱对植物病菌抑菌活性 由表3可知:紫叶小檗果所含小檗碱对测试六种植物病菌均表现出抑菌作用,且抑菌活性与抑菌剂浓度呈现正的量效关系;在小檗碱浓度为4 mg/mL时,小檗碱对六种植物病菌的抑菌效果排序如下:尖孢镰刀病菌(F.o.)>苹果腐烂病菌(C.s.)>番茄灰霉病菌(B.c.)>水稻稻瘟病菌(M.g.)>马铃薯干腐病菌(F.s.)>苹果炭疽病菌(C.g.);小檗碱对尖孢镰刀病菌(F.o.)抑制作用最为显著,当小檗碱浓度达到4 mg/mL时对于尖孢镰刀病菌的抑菌率达到89.28%。在小檗碱梯度浓度下各组抑菌率差异显著。

表3 小檗碱对植物病菌的抑菌活性实验结果Table 3 Experimental results of berberine’s antibacterial activity against plant pathogens

2.3.2 葛根与小檗果配伍组分对细菌抑菌活性测定 由表4可知:小檗果、葛根与小檗果配伍组分对金黄色葡萄球菌的抑制作用均强于大肠杆菌;在实验范围内对于金黄色葡萄球菌的抑制作用随着紫叶小檗果比重增加而增强,葛根:小檗果质量比0∶50时抑菌圈直径最大达到20.42 mm;随着葛根比重的增加,配伍抑菌剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用逐渐减弱,并且各组抑菌圈直径均大于葛根:小檗果质量比为50∶0组,但此组抑菌圈直径大于滤纸片直径,说明葛根对金黄色葡萄球菌有弱的抑菌活性;葛根与小檗果配伍对大肠杆菌的抑制作用在质量比为6∶44时出现最大值,抑菌圈直径达到12.12 mm,显著高于其他各组(P<0.05),继续增大小檗果用量,直径反而减小,因此,在一定质量比范围内葛根与小檗果配伍对大肠杆菌的抑制具有辅助增强作用,其最佳配伍比例为6∶44。

表4 小檗果及与葛根配伍组分对细菌抑菌活性实验结果Table 4 Experimental results on bacteriostatic activity of fruit of Berberis thunbergii var atropurpureaand components compatible with pueraria

3 结论

本研究以紫叶小檗果为原料,将小檗碱得率作为考察指标,通过单因素和正交实验得到了紫叶小檗果中小檗碱的最佳提取工艺条件,小檗碱得率达到0.198%,柱色谱法进一步为所提取小檗碱进行了分离提纯。体外抑菌实验表明紫叶小檗果所含小檗碱对测试病菌中的尖孢镰刀病菌,具有明显的抑制作用,当小檗碱浓度达到4 mg/mL时对于尖孢镰刀病菌的抑菌率达到89.28%。细菌抑制实验证实小檗果对金黄色葡萄球菌的抑制作用高于大肠杆菌;当葛根与其配伍时对于大肠杆菌的抑制具有辅助增强的作用,最佳配伍为葛根:紫叶小檗质量比6∶44,这为研制针对耐药菌株的中药制剂提供了有效依据。本研究工作有望应用于紫叶小檗果中小檗碱的提取及抑菌剂开发中,为进一步提高紫叶小檗植株的利用价值起到一定的促进作用。