一株木防己拟盘多毛孢的鉴定及其次生代谢产物分析

龙奥亚,闫淑珍,陈双林(南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210023)

拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)是1994年由Steyaert建立命名的一类具有重要经济价值的无性型真菌[1]。1996年,Strobel等从落羽杉的内生真菌Pestalotiopsismicrospora液体发酵产物中发现能够抗癌的物质紫衫醇之后,该属真菌成为研究真菌代谢产物的重要物种[2]。据报道,已从拟盘多毛孢属中分离得到约200多种化合物,包括萜类、酯类、醌类、香豆素类、多肽类、内酯类、生物碱及色酮类化合物等[3]。拟盘多毛孢属真菌的代谢产物复杂多样,除常见的化合物外,也分离得到许多结构新颖且活性显著的代谢产物。Lei等[4]从分离自海绵Phakelliafusca的异角状拟盘多毛孢Pestalotiopsisheterocornis发酵物中分离得到2个化合物,分别是heterocornol C和heterocornol G。heterocornol C对人肺癌细胞H460有抑制作用,IC50值为18.7 μmol/L,阳性对照阿霉素的IC50值为1.48 μmol/L。heterocornolG对人胃癌细胞BGC-823、人前列腺癌细胞PC-3和人肝癌细胞SMMC-7721有抑制作用,IC50值分别为15.0、21.3、20.2 μmol/L,阳性对照阿霉素的IC50值分别为1.48、1.80、2.24 μmol/L。Zhang等[5]从一株未鉴定的Pestalotiopsissp. ZJ-2009-7-6发酵液中分离得到脑苷类化合物(4E,8E)-N-D-2′-hydroxypalmitoyl-1-O-β-D-glycopyranosly-9-methyl-4,8-sphingadienine,对单纯疱疹病毒(HSV)及肠道病毒71(EV71)均表现出抑制活性,IC50分别达到16.1和74.3 μmol/L。Kuang等[6]从一株未鉴定的Pestalotiopsissp. M-23固体发酵物中分离得到1个drimane类倍半萜化合物11-dehydro-3a-hydroxyisodrimeninol,对枯草芽胞杆菌表现出抑制活性,IC50值为280.27 μmol/L。Xia等[7]从分离自芦苇的拟盘多毛孢菌Pestalotiopsissydowiana发酵物中分离得到pestalotiopyrone G,表现出强蛋白酶抑制活性,IC50为(1.2±0.3) μmol/L,阳性对照环氧霉素的IC50值为0.072 μmol/L。

拟盘多毛孢属真菌,分布广泛,至今已报道了200多个种的名称[3]。其模式菌种为葡萄盘多毛孢Pestalotiposisperioides,分生孢子具有6个细胞,中间4个细胞着色较深,两端为无色透明细胞,具有2根及以上顶生附属丝[8]。相近的属有盘多毛孢属(Pestalotia)、五隔盘单毛孢属(Seiridium)、盘单毛孢属(Monochaetia)、截盘多毛孢属(Truncatella)[9]。拟盘多毛孢属与相近的属在分生孢子数目、颜色;附属丝、载孢器等方面形态特征相近,增加了分类的难度。拟盘多毛孢属真菌拥有丰富的活性代谢产物,包括抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗寄生虫活性等,已成为很多活性代谢产物的主要来源[10]。由于鉴定到种比较困难,多数报道都是以未知种的名称出现,超过一半的拟盘多毛孢属真菌尚未有代谢产物方面的报道。因此,目前对于拟盘多毛孢属真菌资源的鉴定和代谢产物研究尤为重要。

本研究对16072314菌株进行分类学鉴定和次生代谢产物分析。为促进拟盘多毛孢属真菌的资源开发与利用和获得具有高经济价值的真菌代谢产物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

16072314菌株 分离自葡萄状枝瑚菌子实体,由本实验室保藏;葡萄糖、琼脂条 上海生工生物技术有限公司;马铃薯、大米 江苏南京亚东新城华润苏果超市;食用菌栽培袋 湖北京山县新市镇成林菌业店;PDA培养基(g/L):马铃薯200.0,葡萄糖20.0,琼脂条20.0;大米培养基(g/袋):200.0,pH自然,121 ℃灭菌30 min,每隔12 h灭菌1次,共灭菌2次;ITS-PCR扩增引物(ITS1、ITS4)、PCR mix(2×Taq mix) 上海生工生物技术有限公司;柱色谱用硅胶和薄层色谱用硅胶GF254(200～300目,50～71 μm) 青岛海洋化工厂生产;羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20) 上海源叶生物科技有限公司;薄层层析硅胶GF254200～300目 青岛海洋化工厂;甲醇色谱级 美国天地有限公司;二氯甲烷、石油醚等分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;GXZ型智能光照培养箱 南京同立实验仪器有限公司;C1000 Touch Thermal Cycler PCR仪 美国伯乐公司;Power Pac 2000电泳仪 美国伯乐公司;Tanon-3500凝胶成像系统 上海天能公司;CA-1390-1垂直层流洁净超净台 上海净化设备有限公司;DHZ-C大容量恒温振荡器 江苏太仓实验设备厂;BX53F显微镜 日本Olympus公司;1220型分析型高效液相、1100与1200系列制备型高效液相、1290 Infinity LC/6460 QQQ MS液相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;AVANCE III HD 400型核磁共振仪(TMS为内标) 德国Bruker公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的形态学鉴定 采用转接法:用灭菌的接种环从本实验室保藏16072314菌株的试管斜面上挑取少量菌丝,在含有PDA培养基的平板中划线接种。置于26 ℃恒温培养箱中培养3～5 d后,挑取单菌落重新接种于PDA培养基中进行活化。从活化好的16072314菌株的平板中,挑取一块长势均匀1 cm×1cm的菌块,转接于PDA培养基的平板上,将培养皿置于恒温培养箱中在26 ℃下培养,观察并记录菌落的形态特征。

采取直接挑取制片法:以蒸馏水为浮载剂,用灭菌的解剖针在16072314菌株26 ℃,培养7 d后的平板菌落中挑取小黑点,小气泵轻轻吹散,使孢子分散均匀,制成玻片;同时用灭菌的解剖针轻轻挑取靠近培养基下层的小黑点,用灭菌的解剖刀轻轻切片,制成玻片;分别在显微镜下观察分生孢子和载孢器并记录。

1.2.2 菌株的分子生物学鉴定 采用CTAB法[11]提取真菌基因组DNA并作为模板,以通用引物:ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′对菌株进行ITS区域扩增。PCR反应体系为:12.5 μL PCR mix(2×Taq mix),10 μmol/L ITS1,ITS4各1 μL,DNA模板1 μL,加无菌水至25 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30s,55 ℃退火45s,72 ℃延伸1 min,循环35次,72 ℃温育10 min。取5 μL PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下检测。测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。使用SeqMan(DNAStarInc,USA)软件仔细对照测序峰图与碱基序列进行检查分析和校正后,用BLAST软件在GenBank(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST)中进行同源性比对,选取有详细信息的参考菌株和外群菌株,Mega7.0做Clust W多重比对分析,并进行1000次自检,构建NJ(Neighbor-Joining,NJ)系统进化树。

1.2.3 菌株发酵 保藏菌种接种到PDA培养基平板上,26 ℃培养3～5 d。挑取3个活化后的长势均匀1 cm×1 cm大小的菌块,转接到装有100 mL的马铃薯葡萄糖液体培养基的250 mL锥形瓶中,26 ℃下180 r/min摇床培养3～5 d。取种子液并用无菌水配成浓度为1×104个/mL的菌悬液。取10 mL上述菌悬液转接于装有大米固体培养基的17×35×5 cm3栽培袋中,混匀于26 ℃静止培养35 d,共发酵20袋。发酵产物于55 ℃下烘干,粉碎并称重以备用。

1.2.4 产物的分离与纯化 将烘干粉碎后的固体发酵料用甲醇浸提至无色,减压浓缩,获得粗提物41.92 g。粗体物经硅胶柱色谱分离,以二氯甲烷/甲醇(19∶1、17∶3、13∶7、1∶1、9∶1)梯度洗脱,TLC检测并进行合并,得到F1～F5五个部分。F1部分重结晶得到化合物3(20 mg)。F2部分经反复硅胶柱色谱,以石油醚/乙酸乙酯(9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1)梯度洗脱,其中9∶1部分经重结晶得到化合物7(12 mg),1∶1部分经制备薄层色谱分离得到化合物1(16 mg)。F3部分经反复硅胶柱色谱,以石油醚/乙酸乙酯(9∶1,4∶1,7∶3,3∶2,1∶1)梯度洗脱,其中9∶1部分经半制备高效液相色谱分离得到化合物5(12 mg),7∶3部分经半制备高效液相色谱分离得到化合物4(28 mg)。F4部分反复经硅胶柱色谱,以二氯甲烷/甲醇(100∶1～10∶1)梯度洗脱,其中90∶1部分经Sephadex LH-20分离和半制备高效液相色谱分离到化合物6(21 mg),40∶1部分经半制备高效液相色谱分离得到化合物2(12 mg)。F5部分经反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20分离和半制备高效液相色谱得到化合物8(10 mg)。

1.2.5 结构鉴定 采用液相色谱-质谱联用仪和核磁共振波谱仪对化合物的结构进行鉴定。液相色谱条件:色谱柱:SunFireTMC18反相色谱柱(4.6×250 mm,5 μm);流动相比例:70%色谱甲醇;流速:0.6 mL/min;进样量:20 μL;二极管阵列检测器波长:254 nm;柱温箱5～95 ℃;工作压力0～15000 psi;控温自动进样器:4～60 ℃;质谱条件:离子源:电喷雾离子化源(ESI);模式:正、负离子模式;扫描范围:m/z为5～3000;分辨率:R≥2.5 M。核磁条件:根据AVANCE III HD 400型核磁共振仪的相应参数设置,TMS为内标。

1.3 数据处理

质谱数据通过Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis软件处理,获得各化合物的分子量信息。核磁共振波谱数据通过MestReNova软件处理,获得相应的1H-NMR和13C-NMR信息。

2 结果与分析

2.1 菌株的菌落形态和显微特征

PDA培养基上白色菌落生长蓬松,棉絮状,背面无色素积淀,约7 d后菌落里面和菌丝表面出现散落的小黑点即分生孢子堆。载孢体为分生孢子盘,表皮下生,由浅褐色薄壁角细胞组成,直径100～240 μm。分生孢子纺锤形,直或稍弯曲,大小为(20～26) μm×(5～6.1) μm;5个细胞,中间3个细胞暗色,较大,近圆柱形;两端细胞无色,较小,近三角形。顶端附属丝2～3条,多数3条、长5～17.8 μm,基部附属丝2.5～5 μm(图1)。根据形态学观察,参考宋玉等[12]对拟盘多毛孢属真菌形态特征描述的特点,初步确定16072314菌株为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)真菌。

图1 16072314菌株的形态和显微特征Fig.1 Morphology and microscopic characteristics of the 16072314 strain注:A:PDA培养基中菌落形态(正面)；B:PDA培养基中菌落形态(背面)。C:分生孢子显微特征(40×);D:分生孢子器显微特征(40×);标尺:C=10 μm;D=50 μm。

2.2 基于ITS序列的菌株系统发育分析

通过PCR方法扩增16072314菌株的ITS区,获得目的片段414 bp,上传至NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的序列号为:MT364494。采用BLAST程序与GenBank数据库中收录序列比对,结果获得16072314菌株的ITS区序列与序列号LC206587.1的木防己拟盘多毛孢一致性高达100%。根据NJ系统进化树发现:16072314菌株与木防己拟盘多毛孢聚在同一分支中,自检支持率达95%。整个系统发育树成为4个大的分支,外群Robillardasessilis作为一个单独分支,2株Pestalotiopsisvismiae和2株Pestalotiopsismicrospora以97%的自检支持率聚在同一分支;3株Pestalotiopsiscamelliae以99%的自检支持率聚在同一分支(图2)。

图2 根据ITS序列建立的拟盘多毛孢属内种间的分子系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree established according to 16072314 strain’s ITS sequence

综合形态学观察和分子生物学检测结果,以吴文能等[13]和秦绍钊等[14]对木防己拟盘多毛孢的形态学描述为参照,确定16072314菌株的分类学地位为拟盘多毛孢属的木防己拟盘多毛孢Pestalotiopsiscocculi。拟盘多毛孢属的大多数种,一般以植物内生真菌的形式存在,或者以植物病原菌、腐生菌的形式存在。少数从动物体表中分离得到,例如古玉等[15]从大熊猫体表分离得到一株海南拟盘多毛孢Pestalotiopsishainanensis。目前尚未有在食用菌子实体中分离得到的报道。

2.3 化合物结构的波谱鉴定

共分离、鉴定出8个成分,在粗提物中的提取率分别为7-羟基香豆素(0.38%)、阿魏酸(0.29%)、麦角甾醇(0.48%)、对羟基苯甲醛(0.67%)、对羟基苯乙醇(0.29%)、齐墩果酸(0.5%)、β-谷甾醇(0.29%)和过氧麦角甾醇(0.24%)。化合物结构见图3。

图3 化合物1～8的结构式Fig.3 Structures of compounds 1～8

化合物1:浅黄色粉末,ESI-MS:m/z 185.1[M+Na]+。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 10.55(1H,s,-OH),7.93(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),7.53(1H,d,J=8.5 Hz,H-5),6.79(1H,dd,J=8.4,2.3 Hz,H-6),6.72(1H,d,J=2.3 Hz,H-8),6.20(1H,d,J=9.4 Hz,H-3)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 102.6(C-3),111.7(C-8),111.9(C-10),113.6(C-6),130.2(C-5),145.0(C-4),156.0(C-7),160.9(C-9),161.7(C-2)。上述NMR数据与文献[16]对照一致,鉴定为7-羟基香豆素。

化合物2:白色粉末,ESI-MS:m/z 193.0[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 9.53(1H,s,4-OH),7.49(1H,d,J=15.9 Hz,H-7),7.28(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),7.08(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.79(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.36(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),3.82(3H,s,-OCH3)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 56.1(-OCH3),111.4(C-2),115.8(C-5),116.0(C-8),123.2(C-6),126.2(C-1),145.3(C-7),148.3(C-3),149.3(C-4),168.8(C-9)。上述NMR数据与文献[17]对照一致,鉴定为阿魏酸。

化合物3:白色针状结晶(石油醚),ESI-MS:m/z 419.3[M+Na]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 5.59(1H,dd,J=5.7,2.5 Hz,H-6),5.40(1H,dt,J=5.6,2.8 Hz,H-7),5.31-5.01(2H,m,H-22,23),3.74-3.47(1H,m,H-3),1.06(3H,d,J=6.7 Hz,H-21),0.97(3H,s,H-19),0.94(3H,d,J=6.8 Hz,H-28),0.85(3H,d,J=6.5 Hz,H-27),0.84(3H,d,J=6.8 Hz,H-26),0.65(3H,s,H-18)。13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 12.0(C-18),16.3(C-19),17.6(C-28),19.6(C-27),19.9(C-26),21.1(C-21,11),23.0(C-15),28.3(C-16),32.0(C-2),33.1(C-25),37.0(C-10),38.4(C-1),39.1(C-12),40.4(C-20),40.8(C-4),42.8(C-13,24),46.2(C-9),54.5(C-14),55.7(C-17),70.5(C-3),116.3(C-7),119.6(C-6),132.0(C-23),135.6(C-22),139.8(C-5),141.4(C-8)。以上数据与文献[18]相同,鉴定为麦角甾醇。

化合物4:黄色粉末,ESI-MS:m/z 121.0[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 9.79(s,1H,-CHO),7.76(d,J=8.7 Hz,2H,H-2,6),6.94(d,J=8.5 Hz,2H,H-3,5)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 191.4(-CHO),163.8(C-4),132.6(C-2,6),128.8(C-1),116.3(C-3,5)。以上数据与文献[19]相同,鉴定为对羟基苯甲醛。

化合物5:白色粉末,ESI-MS:m/z 137.1[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 9.12(s,1H,-OH),6.99(d,J=8.5 Hz,2H,H-2,6),6.66(d,J=8.5 Hz,2H,H-3,5),4.57(t,J=5.2 Hz,1H,-OH),3.52(td,J=7.3,5.3 Hz,2H,H-8),2.60(t,J=7.3 Hz,2H,H-7)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ155.9(C-4),130.1(C-2,6),129.9(C-1),115.4(C-3,5),63.1(C-8),38.7(C-7)。以上数据与文献[20]相同,鉴定为对羟基苯乙醇。

化合物6:白色粉末,ESI-MS:m/z 479.0[M+Na]+。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 5.17(d,J=4.0 Hz,1H,H-12),3.03(m,1H,H-3),2.75(dd,J=13.9,4.5 Hz,1H,H-18),1.10,0.90,0.88,0.87,0.86,0.72,0.68(s,21H,7×CH3)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 15.6(C-24),16.5(C-25),17.3(C-26),18.5(C-6),23.1(C-11),23.4(C-16),23.8(C-30),26.1(C-27),27.4(C-2),27.7(C-15),28.7(C-23),30.9(C-20),32.6(C-22),32.9(C-7),33.3(C-29),33.8(C-21),37.1(C-10),38.5(C-1),38.8(C-4),39.3(C-8),41.3(C-18),41.8(C-14),45.9(C-19),46.1(C-17),47.5(C-9),55.3(C-5),77.3(C-3),122.0(C-12),144.3(C-13),179.0(C-28)。以上数据与文献[21]相同,鉴定为齐墩果酸。

化合物7:白色针状结晶(氯仿),ESI-MS:m/z 437.2[M+Na]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 5.37(m,1H,H-6),3.55(m,1H,H-3),1.03(s,3H,H-19),0.93(d,J=6.5,3H,H-21),0.83-0.88(9H,H-26,27,29),0.70(s,3H,H-18)。13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 11.9(C-29),12.0(C-18),18.8(C-21),19.0(C-27),19.4(C-19),19.8(C-26),21.1(C-11),23.1(C-28),24.3(C-15),26.1(C-23),28.3(C-16),29.1(C-25),31.7(C-2),31.9(C-7),31.9(C-8),33.9(C-22),36.2(C-20),36.5(C-10),37.3(C-1),39.8(C-12),42.3(C-4),42.3(C-13),45.8(C-24),50.1(C-9),56.1(C-17),56.8(C-14),71.8(C-3),121.7(C-6),140.8(C-5)。以上数据与文献[22]相同,鉴定为β-谷甾醇。

化合物8:白色针状结晶(丙酮),ESI-MS:m/z 429.3[M+H]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 6.53(d,J=8.5 Hz,1H,H-7),6.26(d,J=8.5 Hz,1H,H-6),5.24(dd,J=15.2,7.4 Hz,1H,H-22),5.16(dd,J=15.3,8.2 Hz,1H,H-23),3.99(m,1H,H-3),1.02(d,J=6.6 Hz,3H,H-21),0.93(d,J=6.8 Hz,3H,H-28),0.90(s,3H,H-19),0.85(d,J=6.6 Hz,3H,H-27),0.84(s,3H,H-18),0.83(d,J=6.6 Hz,3H,H-26)。13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 135.4(C-6),135.2(C-22),132.3(C-23),130.8(C-7),82.2(C-5),79.4(C-8),66.5(C-3),56.2(C-17),51.7(C-14),51.1(C-9),44.6(C-13),42.8(C-24),39.8(C-20),39.3(C-12),37.0(C-4),36.9(C-10),34.7(C-1),33.1(C-25),30.1(C-2),28.7(C-15),23.4(C-11),20.9(C-16),20.6(C-21),20.0(C-27),19.7(C-26),18.2(C-19),17.6(C-28),12.9(C-18)。以上数据与文献[23]相同,鉴定为过氧麦角甾醇。

从木防己拟盘多毛孢固体发酵物甲醇浸膏中提取的物质,主要可以分为酚酸类、甾醇类及三萜类化合物。阿魏酸属于酚酸类化合物,提取率为0.29%。阿魏酸仅在少数其他真菌[24]代谢产物中发现,鉴于此,16072314菌株可以作为工业化生产阿魏酸的潜力菌种。麦角甾醇、β-谷甾醇和过氧麦角甾醇属于甾类化合物,提取率分别是0.48%、0.29%和0.24%。而Xing等[25]从异角状拟盘多毛孢Pestalotiopsishetercornis大米固体发酵物中分离得到麦角甾醇、β-谷甾醇和过氧麦角甾醇,提取率分别是0.15%、0.12%和0.11%。齐墩果酸属于三萜类化合物,提取率为0.5%,王艳颖等[26]从番石榴叶内生真菌Pestalotiopsiszonata液体发酵产物中分离得到齐墩果酸,提取率为0.38%。通过与拟盘多毛孢真菌属类似研究中的提取率相比,本研究中甾醇类及三萜类化合物的提取率均有所提高,为木防己拟盘多毛孢真菌资源的利用提供可靠依据。

3 结论

本研究采用形态学观察结合ITS序列分析法将16072314菌株鉴定为木防己拟盘多毛孢,该菌株为首次从食用菌子实体中分离得到。综合运用多种天然产物分离技术对木防己拟盘多毛孢次生代谢产物进行分离纯化,得到了高纯度的8种化合物,分别是7-羟基香豆素、阿魏酸、麦角甾醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯乙醇、齐墩果酸、β-谷甾醇和过氧麦角甾醇。8个化合物均为首次从木防己拟盘多毛孢中分离得到,阿魏酸在拟盘多毛孢属真菌中为首次发现。本文明确了木防己拟盘多毛孢的化学成分,为评价其生物活性和应用前景提供了科学依据。