恩诺沙星人工抗原及多克隆抗体的制备

穆文静，栗 慧，孙丰梅，魏 东

(1.河北北方学院 农林科技学院，河北 张家口 075000；2.河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室,河北 张家口 075000；3.张家口市特色农产品质量安全重点实验室，河北 张家口 075000)

恩诺沙星(enrofloxacin,ENLX)是第一个畜禽专用的氟喹诺酮类药物[1]，因其抗菌广谱、高效低毒、价格低廉等特点而被广泛使用。随着ENLX的大量使用，其残留问题所带来的危害也不容忽视。首先，人类长期摄入含有兽药残留的动物源性食品后，会在体内造成药物蓄积，当累积到一定浓度以后，就会对人体产生相应的毒副作用[2]，严重时对人体造成伤害；其次，畜禽动物反复摄入某一种抗菌药物后，体内会产生相应的耐药菌株[3]，这些耐药菌株可通过动物源性食品进入人体，以至于不能找到相应的对抗药物进行及时治疗，从而给临床治疗带来一定的挑战。因此，加强兽药在动物源性食品中的残留检测和监督具有十分重要的意义。由于ENLX药物残留会给人类的健康带来严重的危害，世界上许多国家都制定了ENLX的最高残留限量标准，其中世界卫生组织推荐恩诺沙星的最高残留限量为40 μg·kg-1[4]，欧盟等许多国家制定了ENLX在牛、猪、家禽的肝、肾、肌肉中的最高残留限量为30 μg·kg-1[5]，食品安全国家标准GB31650—2019[6]制定了ENLX的ADI值为0～6.2 μg·kg。

目前，ENLX药物残留的检测方法主要有：微生物法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳分析法、化学发光法、液相色谱-质谱联用法和免疫分析法等[7]。上述方法各有利弊，其中微生物法适合初步的大量筛选，但其检测灵敏度不高，对氟喹诺酮类药物的检出限一般都高于国家允许的最高残留检测限量，且实验周期较长，实验结果短时间内不容易取得[8]；高效液相色谱法具有较高的灵敏度，但处理复杂，需要昂贵的仪器设备，对操作仪器的工作人员也有较高的要求，因此该方法并不适合广泛推广应用；液相色谱-质谱联用法，具有较高的灵敏度，可以同时鉴别多种成分，从而可以实现同时检测多种残留组分[9]，但该方法与高效液相色谱法都需要具备昂贵的仪器设备，因此并不适合大量样品的现场检测；高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是近年发展起来的新技术，具有操作简单、样品用量少、分析速度快等特点，有利于实际样品的分析，但该方法的缺点是其检测限不能控制在较低的水平下；免疫分析法中的酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)具备操作简单、检测速度快、不需要昂贵的仪器设备等优点，具有专一性，因此广泛用于农药、兽药、激素类的残留检测[10]。

本研究通过免疫BALB/c小鼠并结合间接竞争ELISA法筛选出高特异性的多克隆抗体，该抗体的成功制备为以后开发一种快速、高效的动物源性食品药物残留检测新技术提供了帮助。

1 材 料

1.1 主要试剂

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、恩诺沙星、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司,25%戊二醛购自天津市科密欧化学试剂有限公司,二甲基甲酰胺(dimethylformamide,DMF)购自上海麦克林生化科技有限公司,HRP标记的羊抗鼠IgG、TMB显色液来自北京索莱宝公司,Tween-20购自阿拉丁化学品有限公司,羊血清来自河北北方学院实验室,BALB/c小鼠来自河北北方学院实验动物中心。

1.2 主要仪器

高速离心机(TGL-16A)购自金坛市仪都仪器有限公司，紫外-可见分光光度计购自铂金埃尔默仪器有限公司，电子天平(JJ323BC)北京赛多利斯仪器有限公司，酶标仪购自Thermo公司；JB-2型恒温磁力搅拌器购自上海雷磁新经仪器有限公司，孵育器购自杭州米欧仪器有限公司。

2 方 法

2.1 免疫抗原(ENLX-BSA)

采用戊二醛法制备免疫原，以BSA为载体蛋白，首先称取0.01 g恩诺沙星标准品溶解于3 mL DMF中，室温反应4 h。称取0.03 g BSA充分溶于3 mL PBS中，将ENLX溶液缓慢加入到含有BSA的PBS溶液中，随后再逐滴加入30 μL的25%戊二醛，室温条件下反应4 h。然后将混合液加入到煮沸处理过的透析袋中，用PBS液透析3 d，每天换3次透析液，于4°冰箱中透析，3 d后8 000 rpm离心，离心20 min，取上清液，分装置于-20 ℃保存备用。

2.2 检测抗原(ENLX-OVA)的制备

具体步骤同2.1，用OVA替代BSA。

2.3 完全抗原的紫外扫描光谱鉴定

以PBS缓冲液做为空白对照组，用紫外分光光度计在200～400 nm范围内对ENLX、BSA、OVA、ENLX-OVA、ENLX-BSA 5种试剂进行紫外扫描鉴定，通过观察其最大吸收峰值来鉴定偶联结果。

2.4 动物免疫

选取4～6周大的BALB/c小鼠进行免疫，采取腹腔注射和皮下注射2种免疫方法，每两周免疫1次，共免疫4次，200 μg/只。第一次用免疫原和弗氏完全佐剂的混合液进行小鼠腹部免疫；第二、三次免疫用弗氏不完全佐剂和免疫原的混合液进行免疫，第三次免疫后7 d断尾取血测效价;第四次用免疫原免疫，对小鼠进行眼眶采血。取血离心，取上清液，-20 ℃冷冻保存备用。

2.5 用间接ELISA法测定抗血清效价

2.5.1 间接ELISA操作步骤

1)包被抗原

首先用检测抗原包被酶标板，每孔加100 μL，4 ℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次3 min(简写为3×3，后同)，拍干。

2)加封闭液

取5%羊血清每孔200 μL，37 ℃孵育器中孵育2 h；用PBST(3×3)洗涤，拍干。

3)加一抗

加抗血清每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次，每次3分钟，在吸水纸上拍干。

4)加酶标二抗

加酶标二抗，用PBS缓冲液稀释至合适倍数，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST(3×3)洗涤，拍干。

5)显色

将显色液A、B液充分混匀后加入到酶标板中，避光显色10～20 min。

6)终止

用硫酸终止整个反应，每孔50 μL硫酸，用酶标仪读取各孔A490值[11]。

2.6 标准曲线的制作

无ENLX抑制的A490值为B0，各浓度ENLX抑制的A490值为B；纵坐标以各浓度的A490值转换成%B/B0(抑制率I倒数)，以ENLX对数Lg[ENLX]为横坐标，进行标准曲线的建立。

图1 完全抗原ENLX-BSA紫外图谱扫描

3 结果与分析

3.1 完全抗原的紫外光谱扫描鉴定

由图1可知，ENLX的最大峰值在271 nm处，ENLX-BSA在265 nm处，BSA的最大峰值在278 nm处，肉眼观察发现ENLX、ENLX-BSA、BSA三者的最大峰值都不相同，且偶联物的最大吸收波长向红外区发生了转移，证明免疫抗原偶联成功。

图2 检测抗原ENLX-OVA紫外扫描图谱

由图2可以看出，ENLX的最大峰值在271 nm处，ENLX-OVA的最大峰值在266 nm处，OVA的最大峰值在280 nm处，观察得出ENLX、ENLX-OVA、OVA这三者的最大峰值有明显差异，且ENLX-OVA的最大吸收波长向红外区发生了转移，证明检测抗原偶联成功。

3.2 完全抗原免疫学鉴定结果

第4次免疫后7 d，各组取任意一只小鼠眼眶采血，采用间接ELISA法测定血清中抗体效价，并用酶标仪测每孔在490 nm的A值，选用1.0左右的A值为检测抗原的理想工作浓度，其中ENLX-OVA理想包被浓度为0.5μg·ml-1，血清稀释位数为32 000倍。结果良好，为下一步实验提供了依据。

表1 ELISA检测小鼠抗ENLX血清效价 μg·mL-1

3.3 ENLX ic-ELISA标准曲线的建立

图3 ENLX ci-ELISA标准曲线

恩诺沙星的ic-ELISA检测结果如图3所示。以%B/B0(抑制率I倒数)为纵坐标，以ENLX浓度对数Lg[ENLX]为横坐标，拟和的线性回归直线方程为y=-19.229x+91.957(R2=0.9922)，符合线性关系的判断标准，从图中可见ENLX的最低检测限为1.19 ng·ml-1。

4 讨 论

恩诺沙星(ENLX)不具有免疫性，必须与载体蛋白(BSA、OVA)偶联才可进行小鼠免疫。本实验采用戊二醛法将ENLX与BSA、OVA偶联在一起，对ENLX、ENLX-BSA、ENLX-OVA等偶联物进行紫外扫描，观察其峰值发生了明显移动，说明药物偶联成功。用免疫原免疫小鼠测定效价结果为1：32 000，该结果说明药物成功偶联。传统的免疫方法分为腹腔注射[12-13]和皮下注射[14]两种方法，免疫间隔期为2周[15],免疫的次数为4次[16]。本研究采用皮下注射和腹腔注射两种方法结合在一起对动物进行免疫试验，免疫间隔期为3周，共免疫6次，最后测得的结果显示抗血清IC50和检测限都比赵银丽[16]所测得的检测限低很多。

抗血清效价测定最简单的判定方法是肉眼观察，以阴性对照孔和空白对照孔比较，发现含有特异性抗体的孔呈现橙黄色并且抗体量越多孔的颜色越深。二是通过仪器设备酶标仪进行测定其吸光度值来判定其效价，其中阴性对照血清测定的A值为N，待测抗血清测定的A值为P，若1.5

0.2判为阳性，P/N≤1.5为阴性[17]。ENLX的整个制备过程要求实验所有用到的玻璃器皿必须全部浸泡在酸缸中24 h，之后用大量清水冲洗干净，烘干备用，尽量避免实验器皿不洁影响到药物偶联的最佳效果。

另外，中国对FQNS类药物残留的检测技术还需进一步发展，快速高效的检测技术才更有利于保障食品安全，保障人民的身体健康。同时，也能促进国内畜牧业的快速发展，使中国的养殖业能够迅速与国际接轨[18]。监督管理部门应积极宣传相关的科普知识，使人们了解食用含有兽药残留的动物源性食品对身体的严重危害。科研人员应快速研制出操作简便、检测灵敏的新技术。