索拉菲尼对肝癌HepG2细胞凋亡、耐药及PTEN蛋白表达的影响

祝珊珊， 秦 飞， 陈仲巍， 毕丽伟， 陈 丹， 许 莉， 郑晓辉

(厦门医学院 1.药学系药物检测中心、 2. 厦门市海洋药用天然产物资源重点实验室、 3.机能与临床转化福建省高校重点实验室，福建 厦门 361026)

肝细胞癌作为威胁全球公共卫生安全的第三位致死性癌症[1-3]，由于其预后较低，在早期很难被发现，依靠手术治疗也常导致其易发生转移，目前还未有特效药物的治疗。索拉菲尼(Sorafenib, So)是一种新型多靶向能抑制多种癌基因激酶活性的药物，在治疗肺癌、甲状腺癌、胰腺癌以及乳腺癌中也见报道，也是唯一被批准作为治疗晚期肝癌的系统性药物[4-5]。尽管索拉菲尼提高了肝癌患者的总体生存率，但在肝癌患者中发现了对索拉菲尼的获得性耐药，这导致了不良的治疗预后效果[6-10]。而且，索拉菲尼通过干扰受体酪氨酸激酶(VEGFR，PDGFR)抑制肿瘤血管生成，可能导致严重的肿瘤内缺氧和耐药性。药代动力学的研究发现药物转运蛋白家族成员ATP-结合转运蛋白可将索拉菲尼在体内的原型物质排放至胆小管，与胆汁一起排出体外[11]，证实了索拉菲尼在体内的耐药与患者对索拉菲尼的药物外排作用相关，导致肿瘤对索拉菲尼的耐药性限制了其治疗作用。本研究主要通过对肝细胞癌HepG2的研究，找出索拉菲尼在诱导肝癌细胞增殖和凋亡中的作用，以及在耐药基因表达调控方面的作用机理，为索拉菲尼在体内的耐药找出相关联的靶点基因，为后续化疗药的耐药治疗提供科研依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂索拉菲尼来自福州肿瘤医院，凋亡试剂(Annexin V-FITC/PI)购自Biolegend公司，英国Abcam抗体如下：PTEN抗体(Ab32199)，ABCG2抗体(Ab207732)，GAPDH(Ab181602)，Bcl-2(Ab16495)，Bax(Ab32503)；ABCC2购自CST(#4446)；p-AKT抗体为Proteintech(No 66444-1g)。DMEM培养基，PBS磷酸盐缓冲液购买自Hyclone；胎牛血清和胰酶均购自Gibco；CCK-8试剂盒为上海东仁化学科技有限公司，结晶紫染料购自索来宝(Solarbio)公司。

1.2 主要仪器CO2培养箱(新加坡ESCO,CCL-170B)，荧光显微镜系统(Lecia，DMI8)，流式细胞分析仪(Beckman ，FC500),多功能酶标仪(瑞士Tecan，M1000PRO)，电泳及化学发光凝胶成像系统(美国，Bio-Rad)。

2 方法

2.1 药物配制利用二甲基亚砜(DMSO)将索拉菲尼配置成100 mmol·L-1的母液，并分装保存于-20 ℃冰箱。使用时，用培养基将母液稀释至所需浓度，现配现用。

2.2 肝癌细胞株HepG2细胞复苏自本实验室液氮罐。DMEM培养基(10% FBS，100 U·L-1青链霉素)于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。

2.3 CCK-8法测定细胞活性待细胞长满后，用胰酶消化，计数后将细胞重悬后，细胞5×103·L-1/孔，每组3个复孔，加入配制的不同浓度索拉菲尼溶液(0、1、2.5、5、10、15 μmol·L-1；继续培养箱培养24和48 h，以加0 μmol·L-1组为对照组，不加细胞只加培养基组为调零孔，每孔细胞加入10 μL CCK-8溶液，酶标仪测定细胞吸光值。细胞的相对增殖率/%=(试验孔-调零孔)/(对照孔-调零孔)×100%，计算细胞相对增殖率，实验重复3次。

2.4 结晶紫染色将细胞以1×105·L-1接种于6孔板中，每孔2 mL，均匀分布。24 h后加入不同浓度的索拉菲尼(0、1、2.5、5、10 μmol·L-1)，作用24 h后将旧培养基吸出，PBS缓冲液洗涤2次，每孔加入500 μL配制好的结晶紫染色液，继续放置37 ℃放置20 min后，荧光倒置显微镜下拍照记录。

2.5 流式凋亡检测HepG2传至6孔板，按照(0、1、2.5、5、10 μmol·L-1)浓度加入索拉菲尼处理24 h，取出细胞，胰酶消化后，收集每孔内所有细胞(含上清内的细胞)，加入凋亡染液PI 5 μL/管，FITC 10 μL/管，4 ℃避光孵育20 min，上机分析细胞凋亡数据。

2.6 Western blot 法检测细胞内蛋白表达待细胞长到对数期后，传代至6 cm盘内，24 h后加不同浓度(0、1、2.5、5、10 μmol·L-1)索拉菲尼处理，24 h后，收细胞，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。蛋白Loading buffer 煮沸后-20 ℃冰箱保存。配制10% SDS-PAGE凝胶，每孔上样30 μg提取的细胞总蛋白，进行蛋白含量的实验分析。抗体浓度，PTEN(1 ∶2 000)；p-AKT(1 ∶1 000)；ABCC2(1 ∶5 000)；ABCG2(1 ∶5 000)；Bax(1 ∶2 000)；Bcl-2(1 ∶5 000)；GAPDH(1 ∶5 000)。

3 结果

3.1 索拉菲尼可降低细胞活性如Fig 1A，索拉菲尼能抑制HepG2细胞活性，且浓度在5 μmol·L-1后，药物的抑制作用呈浓度和时间依赖性。结晶紫染色实验也证实，如Fig B和C所示，随着药物作用浓度的增加，HepG2细胞的死亡增多，活性细胞数下降(P<0.05)。

Fig 1 The toxic effects of sorafenib on viability of HepG2 A: CCK-8 detected the cell survival of HepG2 cells by sorafenib; B: Crystal vilote staining analyzed the cell viability of HepG2 cells; C: Crystal violet rates

3.2 索拉菲尼对细胞凋亡的影响索拉菲尼作用于24 h后，流式凋亡双染结果如Fig 2所示，各组细胞的凋亡百分含量见Tab 1。与对照组相比，在1、2.5、5、10 μmol·L-1索拉菲尼作用下，HepG2细胞的早期凋亡和晚期凋亡率均升高(P<0.05)，并呈剂量依赖性。

Tab 1 Apoptosis in HepG2 cells treated with different concentrations of

Fig 2 Apoptosis treated with sorafenib in HepG2 cells analyzed by flow cytometry

3.3 索拉菲尼对肝癌细胞内蛋白表达的影响为探讨索拉菲尼对HepG2的凋亡相关信号通路机制，如Fig 3A所示，HepG2细胞内PTEN、Bax蛋白随着药物浓度的增加而上调；p-AKT、Bcl-2、ABCC2和ABCG2表达下降。PTEN是一个在多数肿瘤中表达缺失的抑癌基因，在索拉菲尼加药诱导后，表达增加，说明索拉菲尼激活了细胞内PTEN的表达。但是否直接激活，还需要进一步研究确定关系。

Fig 3 Protein expression of ABCC2，ABCG2，PTEN，A: Protein bands of ABCC2，ABCG2，PTEN，p-AKT，Bcl-2，Bax and GAPDH in HepG2; B: Relative protein expression levels of ABCC2，ABCG2，PTEN，p-AKT，Bcl-2，Bax *P<0.05 vs sorafenib 0 μmol·L-1 group. So 0：0 μmol·L-1；So1：1 μmol·L-1；So2.5:2.5 μmol·L-1；So5：5 μmol·L-1；So10：10 μmol·L-1

4 结论

作为一种多靶点的激酶抑制剂，索拉菲尼可抑制多种肿瘤细胞的生长，目前主要用于治疗不能手术或者远处转移性肝癌晚期患者[12]。有研究发现，在服用索拉菲尼治疗的晚期肝癌患者体内，pERK和VEGFR-2发生高表达，预示索拉菲尼治疗晚期肝癌的不良预后[7]。而这种不良预后与机体对索拉菲尼产生耐药性有关。

本研究结果发现，索拉菲尼能诱导HepG2细胞凋亡，Western blot实验也证实与凋亡相关基因Bax的表达随索拉菲尼浓度增加而上升，相反，与抑制凋亡有关的基因Bcl-2蛋白表达下降，证实索拉菲尼可诱导凋亡发生。PTEN通常在肿瘤细胞内表达缺失，往往导致PI3K/AKT信号的非正常表达。实验结果显示，索拉菲尼激活了HepG2细胞中PTEN的蛋白表达，提示索拉菲尼可通过激活PTEN的作用降低下游激酶的活性，实验结果证实PTEN下游磷酸激酶p-AKT的蛋白表达随着索拉菲尼的作用发生下降。说明索拉菲尼可能通过PTEN的激活降低p-AKT的活性。既往研究表明p-AKT/PI3K信号通路与ABC转运蛋白家族相关成员ABCC2和ABCG2的表达有关，这类蛋白的表达与药物从细胞内泵出，降低药物疗效而使肿瘤细胞获得耐药的功能相关[13-15]。本实验研究发现耐药基因ABCC2和ABCG2在索拉菲尼作用下表达下降，提示索拉菲尼可能通过降低ABCC2和ABCG2的过表达诱导的肝癌细胞增殖，从而增强肝癌细胞的凋亡。

由此，可以得出索拉菲尼诱导体外肝癌细胞的凋亡进程中，可能通过激活PTEN的表达降低磷酸激酶AKT信号扩增，从而降低耐药基因ABCC2和ABCG2的表达，增加凋亡蛋白Bax的表达，降低抑制凋亡作用蛋白Bcl-2的表达，进而增加索拉菲尼药物在肝癌细胞内的利用率极大限度地诱导肝癌细胞HepG2的凋亡。而PTEN基因在肿瘤细胞内是否直接参与调控耐药基因的表达，这种调控作用与肿瘤细胞系以及索拉菲尼的药物浓度是否有关联，还需要进一步的实验研究。